泡叶藻聚糖提取、脱色及强免疫刺激活性低分子量降解片段制备的研究

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本文以泡叶藻为原料,主要对泡叶藻聚糖的提取、脱色、分离纯化、降解、低分子量降解片段的免疫刺激活性及结构组成进行研究。首先,本论文通过纤维素酶辅助提取法对泡叶藻聚糖的提取工艺进行了研究。以液料比、酶浓度、酶解时间、酶解温度进行单因素试验,以泡叶藻聚糖提取率为响应值,通过响应面分析,确定纤维素酶辅助提取法的最佳提取工艺为:液料比30:1、酶浓度200 U/m L、酶解时间2 h、酶解温度50℃。在此条件下泡叶藻聚糖提取率为14.65±0.21%,与理论值相对误差0.68%,说明与模型预测值相符。与传统的热水浸提法相比,其提取率提高了62.06%。其次,本论文通过比较活性炭吸附、有机溶剂萃取、大孔树脂吸附、H2O2氧化等不同脱色方法对泡叶藻聚糖脱色的影响,选取最优的H2O2氧化法,并进一步以脱色时间、脱色温度、H2O2浓度和脱色p H值进行单因素试验,采用L9(34)正交设计进行试验,以泡叶藻聚糖的白度值和多糖保留率为指标,并分析经各优化工艺脱色后的泡叶藻聚糖对诱导小鼠吞噬细胞产生一氧化氮活性。确定H2O2氧化法脱除泡叶藻聚糖色素最佳工艺条件为:H2O2浓度为8.6%、脱色时间4 h、脱色温度80℃、p H 11.0,泡叶藻聚糖白度达到61.05±1.12%,其白度值提高了4.1倍,多糖保留率为90.02±0.03%。接着,本论文采用三氧化硫-吡啶法对泡叶藻聚糖(NA)进行硫酸化修饰,旨在改善其免疫刺激活性,结果发现,经硫酸化修饰后的泡叶藻聚糖(MA)的硫酸根含量虽然提高,但其不能增强免疫刺激活性。进一步以Na Cl溶液作为梯度洗脱液,采用阴离子纤维素交换层析柱分别对MA、NA进行分级分离,对获得6种组分进行体外免疫刺激活性的研究。结果发现,这6种组分都能明显诱导小鼠巨噬细胞放出NO。为进一步解释抑制NA免疫刺激活性现象,使用EDTA螯合剂处理NA获得NA-EDTA。结果显示,NA-EDTA能够诱导RAW264.7细胞放出NO,表明NA中可能存在金属离子如Fe2+、Zn2+等与泡叶藻聚糖结合从而影响其免疫刺激活性。最后,本论文分别采用酸水解法和自由基氧化降解法制备低分子量泡叶藻聚糖。酸法以盐酸浓度、降解时间和降解温度为试验因素,氧化法以双氧水浓度、降解时间和降解温度为试验因素,对低分子量降解片段制备分别进行单因素试验研究,选取三种最佳酸法降解体系和三种最佳氧化法降解体系制备低分子量泡叶藻聚糖,并利用凝胶柱分别对这六种低分子量聚糖进行纯化,获得分子量在1000-10000 Da范围的四种分级组分并对它们进行体外免疫刺激活性和基本结构的研究,发现这四种低分子量多糖的免疫刺激活性强弱由单糖、硫酸根及糖醛酸共同构成一定构象决定的。
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