论文部分内容阅读
孔雀石绿（MG）是合成的三苯甲烷类染料，因具有高效广谱杀菌作用而曾广泛的应用于水产养殖行业。然而，孔雀石绿在水生动物体内会被代谢成隐性孔雀石绿（LMG），MG和LMG具有致畸致癌致突变的毒性，在包括我国的许多国家内都已严禁使用。但由于其价格便宜，违禁使用的事件屡有发生，给人们的健康带来巨大的隐患。常用的仪器方法，如高效液相色谱法、液质联用法等检测方法所需要的仪器价格昂贵、操作繁复、样品预处理复杂。酶联免疫分析技术（ELISA）是以抗原抗体特异性为基础的特异性检测方法，具有高效快速的优势，尤其适合于高通量样品的筛选。目前，市场上虽有针对MG或LMG的ELISA试剂盒，但至今针对MG与LMG残留总量的ELISA检测方法却鲜有报道。本文根据半抗原合成及偶联方法，结合偶联活性基团的性质进行设计，设计了结构不同的半抗原和人工抗原及其合成方法。以苯甲醛衍生物、N，N-二甲基苯胺为原料，Zncl2为催化剂，在较温和条件下合成出3种LMG半抗原；进一步采用碳二亚胺法和重氮化法将获得的羧基、氨基隐性孔雀石绿（COOH-LMG、NH2-LMG）半抗原分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联，制备隐性孔雀石绿完全抗原。半抗原经纯化后，使用薄层色谱、红外光谱、紫外光谱、高效液相色谱、质谱等分析方法进行鉴定，完全抗原主要使用紫外光谱进行鉴定，结果表明半抗原与全抗原均合成成功。选用2月龄的雄性新西兰种大白兔，以弗氏佐剂为乳化剂乳化完全抗原，免疫不同组别的大白兔，得到的抗血清用化学方法纯化后，用ELISA法鉴定抗血清的质量，对抗血清达到效价要求的兔子放血，分离抗血清。添加甘油对抗血清进行低温保存。用纯化后的抗血清探讨ELISA的最佳工作条件，建立隐性孔雀石绿ELISA方法。结果显示，免疫后得到的抗血清抗体效价达1：64000，IC50值在1.072-15.36μg/L之间。对建立的方法进行考核，考核结果显示隐性孔雀石绿ELISA测定方法的检测下限为0.011μg/L，定量限为0.037μg/L，方法灵敏度、精密度和准确度均能满足LM G残留筛选检测要求。将该方法进一步应用于MG与LMG残留总量测定的探讨中，为检测MG与LMG总量的ELISA试剂盒产品的开发和应用提供一定依据。