上皮性卵巢癌是最常见的卵巢恶性肿瘤之一,其特点是初诊时晚期患者居多。传统治疗手段是手术加以铂类为主的化疗,尽管大多数晚期患者经初次治疗后得到完全缓解,但复发率高,并且复发性卵巢癌治疗效果差。近来关于治疗卵巢癌的新思路主要为口服PARP抑制剂抑制肿瘤细胞的单链损伤修复能力及给予EGFR抗体阻断肿瘤的血管形成,临床试验结果显示它们均能延长患者的无瘤生存期,但并不能改善患者的总体生存率。因为这些治疗策略均不能使卵巢癌患者免于复发及转移,所以找到能够应用于卵巢癌临床治疗的新药显得尤其重要。近年来,将传统中药应用于肿瘤治疗成为中药治疗疾病的一个新领域,其杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞几乎没有损害。目前有许多实验结果表明中药能抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的侵袭能力及促进肿瘤细胞对化疗药的敏感性。槐耳清膏是药用真菌槐耳菌质的提取物,现已获批为国家一类新药。其在临床上的应用已证明对肝癌等有独特疗效。本课题将利用卵巢癌体内体外培养模型观察槐耳清膏对卵巢癌细胞生物学行为的影响,并进一步研究其作用机制,探索中药槐耳清膏对治疗卵巢癌的临床应用价值。本课题共分为三个部分：1.槐耳清膏对卵巢癌细胞生物学行为的影响；2.利用反向蛋白芯片研究槐耳清膏处理后卵巢癌细胞基因表达特点及槐耳清膏作用机制的初步研究；3.槐耳清膏对卵巢癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响。第一部分槐耳清膏对卵巢癌细胞生物学行为的影响目的 研究槐耳清膏对卵巢癌细胞生物学行为的影响。方法 用不同浓度槐耳清膏作用卵巢癌细胞,观察不同时间,用磺基罗丹明(SRB)染色法检测细胞增殖情况。用不同浓度槐耳清膏处理卵巢癌细胞48小时后, 应用流式细胞仪分析细胞凋亡。用5mg／ml槐耳清膏处理卵巢癌细胞24小时后,应用transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。用5mg/ml槐耳清膏处理卵巢癌细胞24小时后,用体外划痕实验检测细胞迁移的变化。结果 (1)槐耳清膏抑制卵巢癌细胞的增殖,并且这种抑制作用呈现出了时间及剂量依赖性。(2)槐耳清膏促进卵巢癌细胞的凋亡,并且这种作用呈现出了剂量依赖性。(3)槐耳清膏显著抑制卵巢癌细胞的侵袭能力。(4)槐耳清膏明显抑制卵巢癌细胞的迁移能力。结论 槐耳清膏对卵巢癌细胞的生物学行为有显著地影响,它能抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭及迁移,促进卵巢癌细胞的凋亡。高转移潜能的卵巢癌细胞对槐耳清膏的处理更敏感。第二部分利用反向蛋白芯片研究槐耳清膏处理后卵巢癌细胞基因表达特点及槐耳清膏作用机制的初步研究目的 分析槐耳清膏处理后卵巢癌细胞基因表达的变化以研究槐耳清膏可能的作用机制,并检测pAKT/mTOR/S6信号通路及经典Wnt信号通路的变化。方法 槐耳清膏处理卵巢癌细胞后,用反向蛋白芯片(RPPA)技术分析比较槐耳清膏处理前后153个增殖、凋亡、侵袭迁移信号通路相关基因蛋白表达变化。用western blot的方法检测槐耳清膏处理后pAKT、AKT、pS6 (S235-236) pS6 (S240-244)、GSK3β、GSK3β、pS9、β-cateni、E-cadherin及Cyclin D1蛋白表达的变化；用RT-PCR方法检测DIXDC1、LRP6及WNT5基因表达的变化；用GSK3P特异性siRNA预处理卵巢癌细胞后,采用western blot方法检测槐耳清膏作用后细胞β-catenin的蛋白表达。结果 (1)槐耳清膏影响卵巢癌细胞增殖、凋亡、粘附及侵袭信号通路相关基因的蛋白表达。(2)槐耳清膏抑制卵巢癌细胞pAKT及pS6的表达。(3)槐耳清膏抑制卵巢癌细胞β-catenin基因的蛋白表达水平,抑制其由胞浆向胞核内转运。(4)槐耳清膏促进卵巢癌细胞GSK3β的表达,抑制GSK3β S9的磷酸化水平。(5)在GSK3β沉默的卵巢癌细胞中,槐耳清膏不能抑制β-catenin的表达。(6)槐耳清膏抑制卵巢癌细胞DIXDC1、LRP6及WNT5基因的表达。结论 槐耳清膏影响卵巢癌细胞增殖、凋亡、粘附及侵袭信号通路相关基因的蛋白表达；槐耳清膏通过抑制pAKT/S6信号通路抑制卵巢癌细胞的生长,通过抑制Wnt/GSK3β/β-catenin信号通路抑制卵巢癌细胞的侵袭迁移。第三部分槐耳清膏对卵巢癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响目的 研究槐耳清膏对卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法 SKOV3细胞经连续传代后,将细胞浓度调整为4×107个/ml。取100u1分别注射于24只裸鼠右侧肩胛部皮下,将裸鼠随机分成4组。进行下列处理：(1)空白组：给予生理盐水200ul,每天1次至观察结束；一周后腹腔注射0.2ml生理盐水,每周1次。(2)槐耳清膏组：灌服槐耳清膏4g/kg(生理盐水配置),每天1次。(3)顺铂组：接种一周后腹腔注射5mg/kg顺铂(稀释至0.2ml),每周1次。(4)槐耳清膏+顺铂组：灌胃槐耳清膏4g/kg(生理盐水配置),每天1次；一周后腹腔注射5mg/kg DDP(稀释至0.2m1),每周1次。比较各组裸鼠体重、移植瘤体积。结果 各组裸鼠的体重变化无明显差异(P>0.05)。观察第22天开始,顺铂组裸鼠移植瘤的体积明显小于空白对照组,差异有统计学意义。而槐耳清膏组及顺铂+槐耳清膏组在观察第34天开始,出现移植瘤体积明显小于空白组,差异有统计学意义。结论 槐耳清膏能抑制卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的生长,槐耳清膏与顺铂联用并没有出现明显地协同抑瘤作用。本实验研究结果提示槐耳清膏除了能抑制卵巢癌细胞的增殖及促进细胞凋亡外,还能抑制卵巢癌细胞的运动能力。槐耳清膏的低毒性以及其对Wnt/GSK3β/β-catenin信号通路的抑制作用,使得其成为靶向抑制上皮性卵巢癌侵袭的一个有前景的治疗策略。