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α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,α-D-galactoside galactohydrolase; EC 3.2.1.22)也称蜜二糖酶,是一种外切糖苷酶,催化移除不同底物中α-连接的末端非还原性D-半乳糖。α-半乳糖苷酶在医疗、食品、化工及饲料等方面有着广泛的应用。在饲料工业中,α-半乳糖苷酶添加剂是去除豆粕中α-半乳糖苷寡糖类抗营养因子的首选方法。饲用α-半乳糖苷酶的生产目前尚未形成产业化,其中,性质优良的α-半乳糖苷酶的发掘是一个亟待解决的关键问题。本研究通过对菌种新颖性和产酶能力的评估,确定了根霉F78(Rhizopus sp. F78)、赤霉F75(Gibberella sp. F75)、链霉菌(Streptomyces sp.)S9和S27及耶尔森氏菌(Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001)为本实验的研究对象。根霉和赤霉都是重要的工业菌种,但未见这2个属中α-半乳糖苷酶基因克隆与表达的相关报道。链霉菌S9和S27是分离自火焰山的2个菌株,生长条件特殊。利用生物信息学的方法,对微生物来源糖苷水解酶36家族的α-半乳糖苷酶序列进行比对和分析,总结该家族的酶蛋白在分子量大小上的差异,进行分类、分析和简并引物设计,通过简并PCR扩增得到来源于研究菌株中编码α-半乳糖苷酶的基因片断,再结合不同的基因克隆方法最终获得这些基因的全序列。因此,基于这对保守基序设计的简并引物可以有效的扩增到糖苷水解酶36家族的α-半乳糖苷酶基因。对5个实验菌株中获得的α-半乳糖苷酶基因进行BLAST比对,分析其编码的氨基酸序列与已报道的α-半乳糖苷酶的氨基酸序列的相似性。结果表明来源于根霉F78的α-半乳糖苷酶Aga-F78最高相似性为45%,赤霉F75的α-半乳糖苷酶Aga-F75最高相似性为69%,链霉菌S9的α-半乳糖苷酶Aga-S9最高相似性为36%,链霉菌S27的α-半乳糖苷酶Aga-S27最高相似性为55%,耶尔森氏菌的α-半乳糖苷酶Aga-Y最高相似性为57%,而5个酶相互之间的相似性介于25-40%。因此,这5个α-半乳糖苷酶基因均具有很高的新颖性。5个α-半乳糖苷酶基因均在大肠杆菌中异源表达,并验证其基因功能,酶纯化后进行了详细的酶学性质研究。5个α-半乳糖苷酶的性质比较表明,真菌来源的α-半乳糖苷酶最适pH值偏酸性,在4.0-5.0间,而细菌来源的则在7.0-7.5的中性范围内;温度特性上,真菌来源的α-半乳糖苷酶最适温度在50-60℃,细菌来源的在35-40℃,Aga-F75-H、Aga-F78-H、Aga-S27-H热稳定性较好;Aga-F75-H和Aga-F78-H对多种蛋白酶有良好的抗性;Aga-Y-H具有一定适冷酶特性,这在其它α-半乳糖苷酶的研究中还未见报道。因此,获得的这些性质各异的α-半乳糖苷酶,不仅具有在不同领域的实际应用价值,也为研究其结构和功能提供了良好的材料。饲料添加剂中,α-半乳糖苷酶常需要与蛋白酶共同作用,以提高饲料中营养物的利用率。另外,酶蛋白对胃肠道内蛋白酶的抗性,可以延长其作用时间,提高其利用效率。所获得的α-半乳糖苷酶与胰蛋白酶共作用降解豆粕的试验显示,其中4种酶单独作用时都可较大幅度提高半乳糖的含量。Aga-F75-H、Aga-F78-H和Aga-S27-H与胰蛋白酶共作用不影响α-半乳糖苷酶的降解能力。对于Aga-F75-H,单独作用时使半乳糖的含量增加了82.42倍,添加胰蛋白酶后降解量又进一步增加了约36%。这些酶学性质表明Aga-F75-H、Aga-F78-H和Aga-S27-H,特别是Aga-F75-H具有很好的饲料工业应用前景。