解淀粉芽孢杆菌转录组学及其表达元件的挖掘与应用

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解淀粉芽孢杆菌是一类重要工业微生物,是多种工业酶如α-淀粉酶、果聚糖蔗糖酶、纤溶酶等生产菌株,也是嘌呤核苷、核黄素等初级代谢产物的工业生产宿主。虽然解淀粉芽孢杆菌全基因组测序早已完成,但是解淀粉芽孢杆菌的转录学一直未得到深入的研究。本研究采用RNA-Seq技术对解淀粉芽孢杆菌XH7转录组进行研究,得到解淀粉芽孢杆菌全基因组水平的转录图谱。提取在LB-rich培养基中培养至对数生长后期的解淀粉芽孢杆菌的RNA样品进行RNA-Seq测序,测序结果显示解淀粉芽孢杆菌4204个基因中共有3936个基因发生转录表达(93.6%),确定了1064个转录起始位点和749个操纵子结构。基于转录组和基因组数据了解了解淀粉芽孢杆菌XH7积累鸟苷的原因是嘌呤从头合成代谢途径中重要中间产物IMP倾向鸟苷的合成,并指出提高嘌呤操纵子的转录水平将有利于解淀粉芽孢杆菌XH7中鸟苷产量的进一步提高。基于RNA-Seq数据,高通量挖掘解淀粉芽孢杆菌新的表达元件。以整合在解淀粉芽孢杆菌XH7基因组的P43-bgaB为对照,根据RPKM值判定解淀粉芽孢杆菌XH7基因组中有288个基因表达强于插入的报告基因bgaB。选择其中表达量最高的8个基因,扩增其启动子区域构建β-半乳糖苷酶的表达质粒,筛选得到Pr2启动子(编码sigW基因)在对数生长后期β-半乳糖苷酶酶活最高(5300 M u/mL),并成功运用于木聚糖酶基因(xyn)的高效表达,为芽孢杆菌属表达提供了一个σW型的强启动子。另外以bgaB作为报告基因,构建了启动子探针载体pBE-bgaB,筛选获得了265个含有解淀粉芽孢杆菌启动子活性片段的重组克隆子库。经过β-半乳糖苷酶酶活的筛选,启动子P41片段的酶活在解淀粉芽孢杆菌中最高达到3017 Miller U/mL。经过RBS Calculator v1.1优化P41启动子的RBS位点,优化后的编号为“382”的RBS位点构建的pBEP41-bgaB(382)质粒β-半乳糖苷酶酶活最高达到6260 Miller U/mL,是未优化的启动子活力的1.9倍,为芽孢杆菌属基因工程改造提供了一个有价值的表达元件。将以上筛选得到的不同强度的启动子Pr2和P41运用于鸟苷基因改造工程中,构建了一系列嘌呤启动子替换菌株,以解除嘌呤启动子的转录阻遏作用,提高嘌呤操纵子转录水平。构建一系列截短嘌呤启动子的工程株以解除嘌呤启动子的转录衰减作用。通过摇瓶发酵考察工程菌株的鸟苷合成能力,替换P41启动子工程菌purE:P41的产量最高达16.25 g/L,比出发菌株(WT)提高了22.5%,而替换了Pr2启动子工程菌purE:Pr2生长受到影响导致产量大大降低,比WT菌株降低了65.78%。通过胞内物质的检测发现工程菌purE::P41胞内IMP含量高于出发菌株。提取工程菌在发酵过程中不同时间点(12 h、24 h、36 h和48 h)的RNA样品,分析嘌呤操纵子的转录情况,得到工程菌purE:P41的嘌呤操纵子的转录得到加强,有利于鸟苷的合成。在嘌呤启动子改造的工程菌purE:P41基础上对其呼吸链进行改造,考察菌体能量利用对鸟苷合成的影响。构建了一系列△cyd工程菌,通过摇瓶发酵考察发现△cyd工程菌的鸟苷含量均有提高,其中purE::P41△cyd工程菌鸟苷产量最高达19 g/L,比WT提高了35.3%。通过胞内有机酸的测定发现△cyd工程菌丙酮酸含量较低,说明代谢途径进入EMP途径减少,增加了PP途径的代谢通量。△cyd工程菌中主要副产物乙酸含量减少,促进了菌体的生长。综合增强嘌呤操纵子的转录并改造其呼吸链的两步的基因工程改造提高了解淀粉芽孢杆菌XH7的鸟苷合成能力。
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