近年来,随着生活水平的不断提高,性早熟儿童的发病率逐年上升,因此对性发育启动调控机制的研究越发受到关注。性发育是个体成熟并获得生殖能力的过程。作为一个复杂性状,性发育的启动受到遗传和环境等多种因素的影响。在哺乳动物体内,性发育启动受到下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)的调控,其所分泌的各种激素水平可以直接调控性发育启动并维持机体的生殖功能。在性发育前,HPG轴被抑制,各项激素分泌较少,因此不足以支持性腺的发育和性激素的合成。下丘脑GnRH神经元是性发育启动的关键,它可以以脉冲的形式分泌促性腺激素释放激素(GnRH)。当性发育启动时,GnRH神经元分泌GnRH的频率和脉冲幅度都显著提高,因此这一现象成为性发育启动的标志性事件。随着对性发育启动调控机制研究的不断深入,有许多调控性发育启动的关键基因被发现,比如GnRH、Kiss1、GPR54等,但是没有一个基因处于性发育过程的核心地位,可以对整个性发育过程负责。由于性发育的过程涉及多种细胞类型、细胞内和细胞间的信号分子,因此性发育过程是由一个高度协调互作的基因网络调控的。目前,通过系统生物学研究,至少有三个功能相关的基因网络被发现,第一个基因网络以肿瘤相关基因为核心,第二个和第三个基因网络分别以lin28b和锌指蛋白基因为核心。基因网络之间还可以通过表观遗传学的方式进行动态调控。值得注意的是,性发育调控基因网络中的基因都是一些转录/转录后调控因子。微小rna(mirna)作为一个重要的转录后调控因子,它可以在多个层面调节基因的表达。目前已经有研究提示mirnas也可以参与性发育启动的调控。在本研究中,我们通过定位克隆的方式在x染色体上发现了参与调控性发育启动的新基因在:mir-505-3p,并在细胞模型和动物模型中验证了其对雌性小鼠性发育启动的抑制功能。从2008年起,本实验室利用性发育启动时间有显著差异的两种近交系小鼠c3h/hej(c3)和c57bl/6j(b6)进行性发育相关基因的研究。我们首先建立c3和b6小鼠的杂交f2代,并对具有极端表型的f2代个体进行全基因组str扫描和遗传分析。我们在6号、13号和x染色体上发现了与雌鼠阴门开启(vaginalopening,vo)时间显著相关的数量性状基因座(qtl)。其中位于x染色体上(dxmit103~dxmit119)约25cm的性发育相关qtl首次被发现,结果已在plosone发表。为了找到该qtl中调控性发育启动的功能基因,我们利用特异区段染色体替换的方法构建同类系,对该qtl进行精细定位。通过不断与c3小鼠回交,我们在回交第7代(n7)中构建了8个同类系,并通过对其表型和基因型的分析成功的将qtl精细定位在位于x染色体rs13483770~rs2905584间约1cm的区段内。本研究从n7代中筛选出在rs13483770~rs29055848区段内为b6基因型的个体,将筛选出来的个体与c3纯系小鼠连续回交,直到n10代。在n10代中挑选出基因型为xbxc(表示该雌鼠的两条x染色体一条来自于c3,一条在qtl区段来自于b6)的雌性小鼠,基因型为xby(表示该雄鼠的x染色体qtl区段来自于b6)和xcy(表示该雄鼠的x染色体来自于c3)的雄性小鼠,分别以xbxc×xcy和xbxc×xby的方式进行杂交,产生的后代为n11代。n11代中的雌鼠有三种基因型,分别是xbxb、xbxc和xcxc。通过比较这三种基因型雌鼠的性发育启动时间,我们在n11代中再次确定该qtl会推迟雌性小鼠性发育启动的这一表型。为了找到该qtl中的功能基因,我们对qtl中的7个蛋白编码基因和一个mirnas基因进行了dna水平和表达量水平的研究。研究发现,在性发育启动前,mir-505-3p在b6小鼠下丘脑中的表达量要显著高于c3,而其他的基因在b6和c3两个品系中的表达并无差异。因此我们初步认为,在x染色体性发育相关qtl中对性发育启动起到抑制作用的基因是mir-505-3p。为了进一步确认mir-505-3p对性发育启动的抑制作用,我们分别在细胞水平和整体动物水平对mir-505-3p的基因功能加以验证。在细胞水平,我们选择永生化的gnrh神经元gt1-7为细胞模型,并以慢病毒转染的方式在gt1-7细胞中稳定过表达mir-505-3p。我们发现,当mir-505-3p的表达量增加时,在gt1-7细胞中调控性发育启动的关键基因例如:gnrh、gpr54、kiss1的表达量显著下降。这说明在该细胞模型中mir-505-3p确实对性发育启动的相关基因产生抑制作用。接着为了进一步解析mir-505-3p的作用机制,通过对过表达mir-505-3p的细胞模型进行表达谱的分析发现,过表达mir-505-3p会使gt1-7细胞中1490个基因的表达量产生2倍以上的表达量变化。对这些差异表达基因进行go分析和kegg分析后发现,过表达mir-505-3p可以使gnrh信号通路受到抑制。为了确定mir-505-3p的靶基因,我们用targetscan对mir-505-3p的靶基因进行了预测并对在gt1-7中高表达的靶基因进行了实验验证。其中靶基因srsf1由于其可以激活调控性发育启动的关键信号通路,例如mtor信号通路而引起我们的关注。我们在稳定表达mir-505-3p的gt1-7细胞中过表达srsf1后发现,原本受到抑制的gnrh、kiss1等性发育调控关键基因的表达量回复。因此我们认为,mir-505-3p可以通过抑制srsf1的表达来抑制性发育启动关键基因。同时我们在动物水平验证了mir-505-3p对性发育启动的调控作用。我们用crispr/cas9的方法成功的构建了mir-505-3p基因敲除小鼠,并在敲除小鼠中对性发育启动的相关表型进行了研究。我们发现,相对于野生型b6小鼠而言,敲除mir-505-3p的小鼠性发育启动时间显著提前;其雌鼠的体重和性腺重量也显著高于野生型小鼠。另外,敲除小鼠的生殖力也受到了影响,对p45的敲除小鼠进行卵巢切片后发现,敲除小鼠卵巢中的黄体个数要显著多于野生型小鼠;而且敲除小鼠表现出较高的难产率和出生后死亡现象。接着我们对敲除小鼠下丘脑中性发育相关基因的表达量进行了检测,我们发现敲除mir-505-3p后,小鼠下丘脑中的srsf1、gnrh、kiss1、gpr54等基因的表达显著提高;除此之外,敲除小鼠血清中的kisspepetin的浓度也显著高于野生型小鼠。实验结果显示,在小鼠中mir-505-3p可能通过抑制Srsf1来抑制小鼠性发育启动,但其背后的机制仍需要进一步的研究。除了miR-505-3p以外,我们还对性发育前后小鼠下丘脑中miRNAs的表达模式进行研究,找到了一组可能参与了性发育启动的miRNAs。另外,本研究还对miRNAs的检测方法和Cripsr/Cas9小鼠的分型方法进行了优化。综上所述,本研究从定位克隆出发,找到了调控性发育启动的新基因:miR-505-3p。无论在细胞水平还是整体动物水平,miR-505-3p都会对性发育的启动产生抑制作用。这些研究使我们对性发育启动的机制和微小RNA的功能的认知更进一步。