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【背景和目的】肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)对许多肿瘤细胞具有选择性诱导凋亡的作用,为肿瘤基因治疗提供了新的方向,但是,耐药情况的出现妨碍了它在临床上的进一步应用。已有研究显示联合化疗、基因治疗以及放疗等均能有效逆转肿瘤细胞对TRAIL的耐药,最近也有研究显示用calpain抑制剂Ⅰ抑制蛋白酶体的活性能有效地逆转结肠癌细胞对TRAIL的耐药。蛋白酶体介导了细胞内多个涉及细胞增殖和死亡的重要蛋白的降解,主要通过ATP/泛素依赖的途径发挥作用。蛋白酶体抑制剂通过对泛素化通路的阻断可诱导多种肿瘤细胞凋亡,被认为是一种很有前途的抗肿瘤药物。近期已有不少研究发现蛋白酶体抑制剂可以逆转肿瘤细胞对TRAIL的耐药,但是其具体机制仍不清楚。由于bortezomib(Velcade或PS-341;中文名为硼替佐米或万珂)是被美国FDA批准应用于临床肿瘤治疗的第一个蛋白酶体抑制剂,在本研究中我们用bortezomib联合重组人TRAIL蛋白作用于对TRAIL获得性耐药的结肠癌细胞(DLD1-TRAIL/R),通过分析耐药细胞的生物学特性,来评估bortezomib逆转结肠癌细胞获得性TRAIL耐药的主要作用机制。【实验方法】对DLD1-TRAIL/R细胞分4组进行处理:联合处理组、bortezomib处理组、TRAIL处理组和未处理组;MTT法检测处理后不同时间点各组细胞的相对存活率,并用流式细胞仪检测G1期细胞百分率;通过Western免疫印迹检测各种凋亡信号分子、死亡受体、Bcl-2家族凋亡相关蛋白的表达水平;用Western免疫印迹法联合Optimas软件检测细胞中Bik蛋白的稳定性,并进行相对定量和计算半衰期;通过转染Bik siRNA阻断Bik蛋白表达后再用流式细胞仪检测各处理组的细胞凋亡率。各处理组间的差异采用非配对的t检验来评估。【结果和讨论】1)Bortezomib联合重组人TRAIL蛋白逆转DLD1细胞对TRAIL的获得性耐药:用不同浓度(0.5μM—5.0μM)的bortezomib联合重组人TRAIL蛋白(20ng/ml)处理DLD1-TRAIL/R细胞后,MTT比色法检测结果显示,联合作用4小时和24小时两个时间点,联合处理组细胞的相对细胞存活率较单用bortezomib组均有明显下降(p＜0.05),说明bortezomib使获得性TRAIL耐药的DLD1-TRAIL/R细胞对TRAIL蛋白治疗重新敏感。进一步的流式细胞仪检测发现联合处理组细胞大量停滞于G1期;2)Bortezomib联合重组人TRAIL蛋白活化耐药细胞的凋亡信号通路:Western免疫印迹结果显示,bortezomib(1μM)联合重组人TRAIL蛋白(20ng/ml)处理后,DLD1-TRAIL/R细胞中各种凋亡信号分子包括caspase-8,caspase-9,caspase-3,Bid,PARP蛋白均明显活化,线粒体中的细胞色素C和Smac蛋白大量地释放到细胞浆中,这些结果提示bortezomib有效地放大了TRAIL介导的凋亡信号,这一放大作用可能主要是通过它启动线粒体凋亡途径而发挥作用的;3)Bortezomib上调耐药细胞中DR5和Bik蛋白的表达:为解释bortezomib逆转TRAIL耐药的可能机制,我们进一步用Western免疫印迹法检测可能成为蛋白酶体抑制剂作用靶点的凋亡信号分子,包括DR4、DR5、Bcl-2家族成员以及XIAP和Survivin等蛋白分子,发现凋亡诱导蛋白Bik的表达水平明显增高,死亡受体DR5的表达轻微增高,而其他分子却无明显变化;4)Bortezomib显著提高耐药细胞中Bik蛋白的稳定性:为了进一步阐明bortezomib上调Bik蛋白的机理,我们用PBS和bortezomib(1μM)分别处理DLD1-TRAIL/R细胞6小时,再加入Cycloheximide(25μg/ml)抑制新蛋白的合成,收集细胞蛋白行Western免疫印迹检测Bik蛋白的表达,并利用Optimas软件进行相对定量和计算半衰期,结果发现PBS处理的细胞Bik蛋白迅速降解,半衰期约为1小时,而bortezomib处理的细胞即使在Cycloheximide作用6小时后,Bik蛋白仍有稳定表达,证明bortezomib通过抑制蛋白降解,提高其稳定性而造成Bik蛋白在耐药细胞中的蓄积;5)转染siRNA阻断Bik能显著削弱bortezomib的逆转耐药作用:通过转染Bik siRNA阻断DLD1-TRAIL/R细胞中Bik蛋白的表达后,bortezomib介导的TRAIL增敏作用被部分抑制,细胞凋亡率显著下降(p＜0.05),这说明Bik蛋白的蓄积可能是bortezomib逆转结肠癌细胞获得性TRAIL耐药的关键。【结论】1)蛋白酶体抑制剂bortezomib可以逆转人结肠癌细胞DLD1对TRAIL的获得性耐药,其机制可能与Bik蛋白蓄积以及DR5表达上调有关,尤其前者可能是其作用的关键所在;2)bortezomib造成耐药细胞Bik蛋白蓄积主要是由于蛋白降解受抑、稳定性提高所致;3)联合使用蛋白酶体抑制剂和TRAIL蛋白可以有效启动凋亡的死亡受体途径和线粒体途径,增强药物的抗肿瘤活性。