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在当下微生物污染引起的疾病暴发模式从局部范围集中式小暴发向全社会范围以散点病例组成的大暴发转变的情形下,为有效识别大暴发,一系列旨在识别、追踪食品微生物传播途径的溯源分析方法应运而生。为了满足当下快速、高通量检测的需求,分子生物学方法在食品微生物的检测中得到了越来越广泛的应用,但相关的参考物质相对匮乏。我国根据管理机构的不同将参考物质（Reference Material,RM）区分为标准物质（GBW）和标准样品（GSB）,其中有证参考物质（Certified Reference Material,CRM）特指附有证书的参考物质。标准样品是衡量检测实验室质量控制工作的标尺,广泛用于卫生防疫、口岸监管、食品安全生产及监督部门的各级实验室以及第三方检测实验室。食源性微生物检测即用型标准样品的研制,有助于解决目前国内食品微生物检测存在的参考物质不足的难题,使具有自主知识产权的标准样品在食品微生物检测领域得到更多的推广和应用,从而摆脱食品微生物检验对国外标准样品的依赖。针对我国适用于肉毒梭菌和创伤弧菌检测的质粒定性标准样品以及斯坦利沙门氏菌检测方法缺乏的现状,本论文研制了含A型、B型、E型、F型毒素基因的肉毒梭菌质粒定性标准样品和创伤弧菌vvh A型、vcg C/E型、16S r RNA A/B型、Bt2/Ser E型质粒定性标准样品;分别建立了肉毒梭菌和斯坦利沙门氏菌多重双启动寡核苷酸-PCR（DPO-PCR）体系,并将4种肉毒梭菌毒素基因质粒定性标准样品、4种创伤弧菌质粒定性标准样品及斯坦利沙门氏菌核酸标准样品应用于食品检测,具体研究内容如下:（1）构建了含4种肉毒梭菌毒素的重组质粒,经测序验证后各制备成质粒标准样品冻干粉450管。参照GB/T 15000.3—2008《标准样品工作导则》系列标准的要求,根据随机函数随机抽取12管,参照GB 4789.12—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验》”对肉毒毒素基因质粒定性标准样品进行PCR定性检测;同时采用紫外分光光度计法测定质粒样品的浓度,质粒含量结果统计分析采用方差分析法。结果显示分别以4种肉毒梭菌毒素基因质粒定性标准样品为模板,均能扩增得到大小正确的目的基因片段且扩增条带单一;电泳检测显示质粒样品条带完整,无降解;质粒样品定量统计学分析表明F值均小于F临界值,表明样品管间无显著差异,均匀性良好,符合预期目标。由于温度是影响质粒标准样品运输过程中稳定性的主要因素,因此设计4°C、37°C、45°C三个温度模拟质粒样品运输温度条件进行质粒样品的短期稳定性分析,分别在第1、3、5、7、9、11、14天取3管样品进行检测分析。在每个取样时间点,以质粒定性标准样品为模板,均能扩增得到大小正确的目的基因片段且扩增条带单一;电泳检测显示质粒样品条带完整,无降解;根据GB/T 15000.3—2008/ISO Guide 35:2006《标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法》,稳定性研究采用线性拟合作为基本模型,t检验分析结果显示斜率不显著,说明质粒样品未观测到不稳定性。上述结果表明肉毒梭菌毒素基因质粒样品能在4°C、37°C条件下稳定保存14天;在45°C条件下保存9天,样品仍保持稳定。除了运输稳定性,还检测分析了质粒样品的长期稳定性（储存稳定性）。在-20°C条件下,分别在第1、2、4、6、8、10、12个月时,取出样品进行检测分析。结果表明质粒样品在上述每一个时间点,均检测到目的基因且电泳条带清晰,质粒样品电泳条带完整,定量检测t检验未观察到不稳定性,说明样品在-20°C可稳定保存至少12个月。经中国合格评定国家认可委员会（CNAS）认证的国家食品安全风险评估中心、山东省食品药品检验研究院、丹东海关综合技术服务中心及其他有相关资质的8家单位联合定值,结果显示该4种质粒标准样品与预期一致。综上,构建了符合商业要求的肉毒梭菌毒素基因质粒定性标准样品。（2）参照肉毒梭菌毒素基因质粒定性标准样品的研制方法,研制了创伤弧菌质粒定性标准样品。首先构建了创伤弧菌毒力vvh A基因及分型vcg C/E、16S r RNA A/B、Bt2/Ser E基因的4个重组质粒,经测序验证后制备成质粒标准样品冻干粉各450管。参照GB 4789.44—2020《食品安全国家标准食品微生物学检验创伤弧菌检验》对创伤弧菌质粒定性标准样品进行PCR定性检测;同时采用紫外分光光度计法测定质粒样品的浓度,并进行定量分析。均匀性检验结果表明样品管间无显著差异,均匀性良好,符合预期目标。短期稳定性检验结果表明创伤弧菌质粒标准样品能在4°C、37°C条件下稳定保存14天;长期稳定性检验结果表明创伤弧菌质粒标准样品能在-20°C条件下稳定保存至少12个月。上述结果表明创伤弧菌质粒定性标准样品的均匀性和稳定性均符合国家定性标准样品的要求,为创伤弧菌的快速、高通量定性鉴定和分型分析提供了可靠的参考物质。（3）建立了斯坦利沙门氏菌的四重DPO-PCR检测体系,与传统PCR方法相比,该方法在49°C-58.5°C退火温度条件下均有较好的扩增效果,条带清晰,特异性良好,灵敏度达到0.7 ng/μL。利用该技术在95份食品样本中检测出2份阳性样品,经传统培养法验证,均为阳性样品,说明该技术准确可靠。由此,建立了灵敏度高且速度快的斯坦利沙门氏菌检测体系。（4）建立了肉毒梭菌四重DPO-PCR检测体系,结果表明以肉毒梭菌毒素基因质粒定性标准样品为模板的DPO-PCR体系在53.6°C-62°C退火温度条件下均能扩增出四条目的条带,灵敏度达到0.002 ng/μL,具有良好的特异性,在15份食品样本的适用性检验中,检出率为100%,说明所研制的肉毒梭菌毒素基因质粒定性标准样品实用有效,并且所建立的四重DPO-PCR检测体系为肉毒梭菌的快速检测提供了一种新的方案。（5）为了检验创伤弧菌质粒定性标准样品在食品检测中的应用,参照GB 4789.44—2020《食品安全国家标准食品微生物学检验创伤弧菌检验》的检验方法,将4种创伤弧菌质粒定性标准样品作为阳性对照,用于检测鱼类、贝类等10份海鲜类样本。结果表明,在所有样品中检测出1份阳性样品,经传统培养法验证其确为创伤弧菌。由此,证明本论文所开发的创伤弧菌质粒定性标准样品具有较好的商业应用潜力,为其进一步的推广应用奠定了重要基础。本论文研制了适用于食品中肉毒梭菌和创伤弧菌快速检验的质粒定性标准样品,并在食品检测中验证了它们的准确性和可靠性,为GB4789的实施奠定了强有力的物质基础和技术支持。质粒定性标准样品的建立,省去了阳性对照病原菌的培养步骤,既节约了成本,又保障了食品检验机构和食品安全监管部门检验人员的人身安全。此外,构建了肉毒梭菌和斯坦利沙门氏菌的DPO-PCR体系,为此二者的快速检测提供了新的思路和方案,省去了多基因检测的繁琐操作,大大缩短了检测时间,提高了检测效率。综上所述,本论文的研究成果为食品中肉毒梭菌、创伤弧菌和斯坦利沙门氏菌的高效快速检验提供了坚实有力的支持,同时有利于提升我国食源性病原菌的快速检测水平。