由于冷冻干燥法具有其它长期保存法无法比拟的一些优点,该方法已成为细胞长期保存方法中新的研究热点。所以冻干保存也有可能成为最有效的红细胞长期保存方法。但影响冻干细胞回收率的因素非常多,包括冻干前红细胞的处理、保护剂组成(成份和浓度)、添加洗涤方式、冷冻过程、干燥过程和复水等。维持红细胞胞膜完整性和红细胞的生理功能是红细胞冻干成功的关键点和难点。本论文将围绕红细胞在冻干前负载海藻糖及其对红细胞理化特性的影响、冻干保护液的选择、冻干过程中对红细胞的影响因素以及复水条件对红细胞回收率的影响这一条主线展开讨论,通过大量的实验研究这些因素对人的红细胞冻干效果的影响,并对人红细胞冻干和复水方法进行优化。一、冻干前人红细胞对海藻糖的负载及其对红细胞理化特性的影响第一部分研究了红细胞负载海藻糖的影响因素和有效方法,并通过评价负载海藻糖对红细胞各项理化指标的影响,证明负载后红细胞仍然能较好的执行其生理功能。使用硫酸-蒽酮法测定胞内海藻糖含量,同时对胞外游离血红蛋白水平进行评价。检测负载后红细胞各项理化指标,通过流式细胞术检测负载后红细胞膜的完整性。结果显示红细胞对海藻糖的负载量和负载温度、时间及负载缓冲液海藻糖浓度密切相关,随温度的升高、时间的延长和负载缓冲液海藻糖浓度的增加,红细胞对海藻糖的摄取量也随之增加。两组红细胞各项理化指标比较结果为两组各项指标间无显著差异((p＞0.05))。流式结果显示红细胞在高渗环境中负载海藻糖后,细胞膜结合很少量Annexin-V-FITC,并且破损红细胞能被有效清除。确定红细胞负载海藻糖的最佳条件,即,在37℃条件下,采用新鲜红细胞在海藻糖浓度为800mmol/L的负载缓冲液中孵育7h能有效摄取海藻糖,且保持细胞的理化稳定性和膜结构完整性,为红细胞的长期冻干保存奠定了基础。二、人红细胞冻干保存中保护剂和冻干程序的优化第二部分中通过一系列对比实验,比较了不同保护剂浓度组成和冻干程序中冻干前红细胞降温速率、搁板最低温度、升华干燥和解析干燥不同的升温速率等几种参数的设置对红细胞冻干复水后存活率的影响。根据上述实验结果,后续实验中将选择如下保护剂来冻干红细胞:0.8mol/LGlycerol+15%PVP40+150mmol/L海藻糖+2%RSA,其pH为7.3,。冻干中采用液氮快速降温,即将液氮喷溅于冻干瓶上,使之达到平衡,然后迅速取出放置到已经预冷至-70℃的搁板上开始冻干。冻干程序为:升华干燥中,设定搁板温度保持为-70℃1h、-60℃2h、-50℃2h、-40℃2h、-30℃2h、-25℃2h、-20℃2h、-15℃2h、解析干燥中,设定搁板温度保持为-10℃1h、0℃1h、10℃2h,干燥腔体内压力设定为150mTorr～200mTorr(约20Pa～27 Pa)。冷凝器温度为-85℃。整个干燥过程持续时间大约19个小时。三、冻干人红细胞复水条件的初步研究本部分通过研究不同复水条件对冻干红细胞回收率的影响,包括复水溶液、复水温度、复水阶段红细胞胞体积变化速率(即蒸汽预复水)等,对冻干红细胞复水条件的优化进行初步研究,并检测了冻干红细胞复水后其各项理化功能的改变。(1)不同复水条件对冻干红细胞回收率的影响结果为:采用以PBS为基液配制的10%(w/v)PVP40溶液效果较好。比较不同复水温度的影响,低于37℃时,红细胞回收率随着温度的升高而增加,42℃比37℃略差,即37℃下复水效果最好。在加入复水液之前将样品放置在37℃的饱和蒸汽环境中预复水能提高红细胞回收率。并使细胞体积和体积分布宽度更接近于新鲜细胞数值。(2)通过对复水后红细胞理化性质的研究,发现红细胞的变形性较常规保存红细胞有所下降,但胞内ATP酶、G-6-PD酶、SOD和2,3-DPG的活性降低较少,大于红细胞回收率,说明红细胞在我们制备的冻干保护剂与设定的冻干过程下冻存后,细胞生化活性保存较好。同时也提示也提示对冻干复水过程中的细胞膜的保护还需进行更深入的研究。