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目的：
非特殊型弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma，no specific type,DLBCL,NOS）是起源于B细胞的恶性肿瘤，占所有淋巴瘤的40.1%，是一种最常见的非霍奇金淋巴瘤（NHL），无论是在临床表现还是免疫学、分子形态学以及预后，DLBCL均具有高度的异质性。近年来利妥昔单抗+化疗(R-CHOP)方案已成为临床治疗DLBCL的标准一线免疫化疗方案，使得DLBCL患者的治愈率显著提高，但仍有近40%的患者易复发或进展，预后不佳。评价DLBCL预后的国际预后指数(International Prognostic Index,IPI)在评价预后系统中的地位随着美罗华的广泛应用和免疫治疗时代的开启而不断受到挑战和冲击。由于IPI已不能作为判断预后的最完美的模型，因此寻找更多的能够指导临床治疗或预后评估的生物学指标已成为近年来的研究热点。
机体的免疫功能与肿瘤的发生、发展关系密切，当宿主免疫功能低下或受抑制时，肿瘤发病率增高。细胞免疫在宿主对肿瘤的免疫应答效应中起着主力作用，T淋巴细胞不仅是细胞免疫的效应细胞，在调节免疫反应中也起着重要作用。CD3阳性细胞是总T细胞水平的代表，而T细胞按其CD分子表型的不同，可分为CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞。在临床上常常通过检测外周血T淋巴细胞亚群，观察DLBCL患者细胞免疫状态，从而判断机体免疫功能状态进而预测临床预后情况。有研究提出肿瘤微环境对淋巴瘤的发生和进展起着重要作用，但是有关DLBCL微环境中T淋巴细胞数量与临床病理特征关系的研究报道较少。巨噬细胞是肿瘤微环境中重要组成部分，肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAM)对不同恶性肿瘤预后影响的机制尚未明确。有研究指出TAM与乳腺癌及滤泡性淋巴瘤患者的预后密切相关，可作为评估预后的独立因素，但TAM与DLBCL患者预后的关系尚存争议。巨噬细胞可分化为Ml型和M2型巨噬细胞，在肿瘤组织中，TAM通常被定向极化为具有免疫抑制效应的M2型巨噬细胞，目前常用CD163抗体对M2型巨噬细胞进行标记。因此，研究肿瘤微环境中CD3、CD4、CD8及CD163与DLBCL临床病理特征及预后的关系具有重要的意义。EB病毒为广泛存在的疱疹病毒，被认为是多种肿瘤发生的重要影响因素，可引起细胞免疫功能异常，特别是细胞免疫功能降低，使机体免疫力下降。有研究指出，EB病毒可促使巨噬细胞亚群的极化，感染的肿瘤细胞可分泌IL-10，从而促进巨噬细胞向M2型分化，形成M2型TAM促进DLBCL的发展。
因此本研究选取DLBCL患者为研究的对象，以免疫组化方法检测T淋巴细胞亚群及肿瘤相关巨噬细胞的分子标记物在DLBCL患者中的表达情况，以原位杂交的方法检测EB病毒的感染情况，分析这些指标与DLBCL临床病理参数及预后的关系，探讨DLBCL的肿瘤微环境对其预后的影响，为临床治疗及预后评估提供研究依据。
方法：
1.回顾性分析大连医科大学附属第二医院2013年1月至2018年12月期间收治的62例非特殊型弥漫大B细胞淋巴瘤（以下简称弥漫大B细胞淋巴瘤或DLBCL）患者的完整临床资料以及病理组织切片及蜡块标本，所有入选患者均行手术活检经过临床组织病理学检查及免疫组织化学检查确诊为DLBCL。
2.应用免疫组化的方法检测CD3、CD4、CD8、CD163蛋白的表达情况，采用原位杂交的方法检测EB病毒的表达情况，结合患者的临床相关资料（性别、年龄、Ann Arbor分期、发病部位、IPI评分、乳酸脱氢酶水平、病理分型、治疗效果和生存情况）分析上述标记物的表达情况及其与临床病理特征之间的关系。
3.应用免疫组化双染法与原位杂交套染技术检测在DLBCL中EB病毒感染的细胞类型。在同一张切片中首先进行EB病毒原位杂交，再用CD3和CD20抗体进行免疫组化染色标记T/B淋巴细胞，结果可在同一张切片中观察到EB病毒感染的细胞是T淋巴细胞还是B淋巴细胞。
4.统计学方法：采用SPSS22.0统计软件对实验数据进行统计分析，计数资料的组间比较采用χ2检验，Fisher确切概率法。以P＜0.05表示差异有统计学意义。
结果：
1.临床病理资料
共纳入62例DLBCL患者，其中男性33例，女性29例，男女比例约为1.1∶1；患者年龄32-83岁，以老年患者为主，60岁以上（包括60岁）患者有46例，中位发病年龄为66岁；临床分期采用Ann Arbor分期标准，以Ⅲ期（43.55%）和Ⅳ期（35.48%）患者居多；发病部位以结内多见，结内结外比例约为1.8：1；IPI评分高评分（3-5分）者稍多（56.45%）；血清乳酸脱氢酶（LDH）水平升高者（≧245IU/L）占多数。病理诊断按照Hans分型标准分为生发中心型（GCB）DLBCL和非生发中心型（non-GCB）DLBCL，本组以non-GCB病例占多数（79.03%）；治疗无效者占66.13%；总生存期（OS）超过一年的患者占58.06%。
2.免疫组化结果
（1）CD3在DLBCL背景组织中有不同程度表达；CD3阳性细胞百分比为8%-82%，中位百分数为39%。CD3阳性细胞百分比与IPI评分相关（Χ2=5.035，p=0.025）；在CD3低表达组中IPI评分高（3-5分）的病例占多数（69.70%，23/33），而在CD3高表达组中则以IPI评分低（0-2分）的病例数居多（58.62%，17/29）；其他临床病理参数与CD3阳性表达率无相关性。
（2）CD4在DLBCL组织中表达的阳性百分率为2%-55%，中位阳性表达率为18%。CD4阳性表达率的高低与临床病理参数无相关性。
（3）CD8在DLBCL组织中的阳性百分比为1%-40%，中位阳性表达率为14.5%。CD8阳性表达情况与IPI评分和EB病毒感染相关（P＜0.05）。CD8高表达组中IPI低评分者占多数（59.26%，16/27），在CD8低表达组中IPI高评分者占多数（68.57%，24/35）；EB病毒阳性组中以CD8高表达的病例数较多（64.71%，11/17）。其他临床病理参数与CD8阳性表达率无相关性。
（4）CD4/CD8比值与EB病毒感染相关（Χ2=6.758，p=0.009）。在EB病毒阳性病例中，CD4/CD8比值<2.0的比例率较高（94.12%，16/17），而CD4/CD8比值与患者其他临床病理特征之间无相关性。
（5）CD163在DLBCL组织中有不同程度表达，阳性细胞所占百分比为7%-75%，中位百分比为35%。CD163阳性表达百分比与疗效相关（Χ2=4.249，p=0.039）；在CD163高表达组中治疗无效的百分率（78.12%，25/32）高于有效组（21.88%，7/32）。其他临床病理参数与CD163阳性表达率之间无相关性。
3.原位杂交结果
原位杂交检测结果显示肿瘤组织中EB病毒阳性者占27.42%。EB病毒感染与患者年龄相关（Χ2=5.914，p=0.015）；EB病毒阳性组中年龄≧60岁的病例占94.12%（16/17）。其他临床病理参数与EB病毒感染无相关性。
4.临床病理特征之间相关性结果
（1）62例样本中GCB组13例，non-GCB组49例。病理分型与疗效和总生存率（OS）相关。GCB组中治疗有效率（69.23%，9/13）高于治疗无效率（30.77%，4/13），non-GCB组中治疗无效率（75.51%，37/49）高于治疗有效率（24.49%，12/49）；GCB组中OS>1年的比例（84.62%，11/13）显著高于OS≦1年的比例（15.38%，2/13）。其他临床病理特征与病理分型之间无相关性。
（2）62例患者中结内DLBCL40例，结外DLBCL22例。发病部位与患者的临床病理特征无相关性。
（3）根据DLBCL患者疗效判定标准将其分为无效组（SD+PD）和有效组（CR+PR）。62例患者中治疗无效组41例，有效组21例。疗效与Ann Arbor分期、IPI评分、血清LDH水平及病理分型相关。治疗无效组中临床分期高、IPI评分高、血清LDH水平升高以及non-GCB亚型的病例数较多。其他临床病理特征与疗效间无相关性。
5.免疫组化双染法与原位杂交套染结果
先行原位杂交用DAB棕色显色系统，再行免疫组化双染法（先用AEC红色显色系统，再用DAB棕色显色系统）染色效果更好。结果显示在DLBCL中EB病毒阳性细胞主要是肿瘤细胞（B淋巴细胞）。
结论：
1.DLBCL组织中CD3、CD8高表达与IPI低评分相关，提示DLBCL微环境中CD3和CD8阳性T细胞增多是肿瘤预后较好的指标。
2.DLBCL组织中CD4阳性细胞数与临床病理参数无相关性。
3.DLBCL组织中CD163高表达与治疗无效率相关；提示DLBCL微环境中CD163阳性的巨噬细胞增多预示治疗效果不佳。
4.在DLBCL中EB病毒主要感染肿瘤细胞。
5.免疫组化双染法与原位杂交套染技术中先行原位杂交后行免疫组化染色效果更好。
非特殊型弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma，no specific type,DLBCL,NOS）是起源于B细胞的恶性肿瘤，占所有淋巴瘤的40.1%，是一种最常见的非霍奇金淋巴瘤（NHL），无论是在临床表现还是免疫学、分子形态学以及预后，DLBCL均具有高度的异质性。近年来利妥昔单抗+化疗(R-CHOP)方案已成为临床治疗DLBCL的标准一线免疫化疗方案，使得DLBCL患者的治愈率显著提高，但仍有近40%的患者易复发或进展，预后不佳。评价DLBCL预后的国际预后指数(International Prognostic Index,IPI)在评价预后系统中的地位随着美罗华的广泛应用和免疫治疗时代的开启而不断受到挑战和冲击。由于IPI已不能作为判断预后的最完美的模型，因此寻找更多的能够指导临床治疗或预后评估的生物学指标已成为近年来的研究热点。
机体的免疫功能与肿瘤的发生、发展关系密切，当宿主免疫功能低下或受抑制时，肿瘤发病率增高。细胞免疫在宿主对肿瘤的免疫应答效应中起着主力作用，T淋巴细胞不仅是细胞免疫的效应细胞，在调节免疫反应中也起着重要作用。CD3阳性细胞是总T细胞水平的代表，而T细胞按其CD分子表型的不同，可分为CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞。在临床上常常通过检测外周血T淋巴细胞亚群，观察DLBCL患者细胞免疫状态，从而判断机体免疫功能状态进而预测临床预后情况。有研究提出肿瘤微环境对淋巴瘤的发生和进展起着重要作用，但是有关DLBCL微环境中T淋巴细胞数量与临床病理特征关系的研究报道较少。巨噬细胞是肿瘤微环境中重要组成部分，肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAM)对不同恶性肿瘤预后影响的机制尚未明确。有研究指出TAM与乳腺癌及滤泡性淋巴瘤患者的预后密切相关，可作为评估预后的独立因素，但TAM与DLBCL患者预后的关系尚存争议。巨噬细胞可分化为Ml型和M2型巨噬细胞，在肿瘤组织中，TAM通常被定向极化为具有免疫抑制效应的M2型巨噬细胞，目前常用CD163抗体对M2型巨噬细胞进行标记。因此，研究肿瘤微环境中CD3、CD4、CD8及CD163与DLBCL临床病理特征及预后的关系具有重要的意义。EB病毒为广泛存在的疱疹病毒，被认为是多种肿瘤发生的重要影响因素，可引起细胞免疫功能异常，特别是细胞免疫功能降低，使机体免疫力下降。有研究指出，EB病毒可促使巨噬细胞亚群的极化，感染的肿瘤细胞可分泌IL-10，从而促进巨噬细胞向M2型分化，形成M2型TAM促进DLBCL的发展。
因此本研究选取DLBCL患者为研究的对象，以免疫组化方法检测T淋巴细胞亚群及肿瘤相关巨噬细胞的分子标记物在DLBCL患者中的表达情况，以原位杂交的方法检测EB病毒的感染情况，分析这些指标与DLBCL临床病理参数及预后的关系，探讨DLBCL的肿瘤微环境对其预后的影响，为临床治疗及预后评估提供研究依据。
方法：
1.回顾性分析大连医科大学附属第二医院2013年1月至2018年12月期间收治的62例非特殊型弥漫大B细胞淋巴瘤（以下简称弥漫大B细胞淋巴瘤或DLBCL）患者的完整临床资料以及病理组织切片及蜡块标本，所有入选患者均行手术活检经过临床组织病理学检查及免疫组织化学检查确诊为DLBCL。
2.应用免疫组化的方法检测CD3、CD4、CD8、CD163蛋白的表达情况，采用原位杂交的方法检测EB病毒的表达情况，结合患者的临床相关资料（性别、年龄、Ann Arbor分期、发病部位、IPI评分、乳酸脱氢酶水平、病理分型、治疗效果和生存情况）分析上述标记物的表达情况及其与临床病理特征之间的关系。
3.应用免疫组化双染法与原位杂交套染技术检测在DLBCL中EB病毒感染的细胞类型。在同一张切片中首先进行EB病毒原位杂交，再用CD3和CD20抗体进行免疫组化染色标记T/B淋巴细胞，结果可在同一张切片中观察到EB病毒感染的细胞是T淋巴细胞还是B淋巴细胞。
4.统计学方法：采用SPSS22.0统计软件对实验数据进行统计分析，计数资料的组间比较采用χ2检验，Fisher确切概率法。以P＜0.05表示差异有统计学意义。
结果：
1.临床病理资料
共纳入62例DLBCL患者，其中男性33例，女性29例，男女比例约为1.1∶1；患者年龄32-83岁，以老年患者为主，60岁以上（包括60岁）患者有46例，中位发病年龄为66岁；临床分期采用Ann Arbor分期标准，以Ⅲ期（43.55%）和Ⅳ期（35.48%）患者居多；发病部位以结内多见，结内结外比例约为1.8：1；IPI评分高评分（3-5分）者稍多（56.45%）；血清乳酸脱氢酶（LDH）水平升高者（≧245IU/L）占多数。病理诊断按照Hans分型标准分为生发中心型（GCB）DLBCL和非生发中心型（non-GCB）DLBCL，本组以non-GCB病例占多数（79.03%）；治疗无效者占66.13%；总生存期（OS）超过一年的患者占58.06%。
2.免疫组化结果
（1）CD3在DLBCL背景组织中有不同程度表达；CD3阳性细胞百分比为8%-82%，中位百分数为39%。CD3阳性细胞百分比与IPI评分相关（Χ2=5.035，p=0.025）；在CD3低表达组中IPI评分高（3-5分）的病例占多数（69.70%，23/33），而在CD3高表达组中则以IPI评分低（0-2分）的病例数居多（58.62%，17/29）；其他临床病理参数与CD3阳性表达率无相关性。
（2）CD4在DLBCL组织中表达的阳性百分率为2%-55%，中位阳性表达率为18%。CD4阳性表达率的高低与临床病理参数无相关性。
（3）CD8在DLBCL组织中的阳性百分比为1%-40%，中位阳性表达率为14.5%。CD8阳性表达情况与IPI评分和EB病毒感染相关（P＜0.05）。CD8高表达组中IPI低评分者占多数（59.26%，16/27），在CD8低表达组中IPI高评分者占多数（68.57%，24/35）；EB病毒阳性组中以CD8高表达的病例数较多（64.71%，11/17）。其他临床病理参数与CD8阳性表达率无相关性。
（4）CD4/CD8比值与EB病毒感染相关（Χ2=6.758，p=0.009）。在EB病毒阳性病例中，CD4/CD8比值<2.0的比例率较高（94.12%，16/17），而CD4/CD8比值与患者其他临床病理特征之间无相关性。
（5）CD163在DLBCL组织中有不同程度表达，阳性细胞所占百分比为7%-75%，中位百分比为35%。CD163阳性表达百分比与疗效相关（Χ2=4.249，p=0.039）；在CD163高表达组中治疗无效的百分率（78.12%，25/32）高于有效组（21.88%，7/32）。其他临床病理参数与CD163阳性表达率之间无相关性。
3.原位杂交结果
原位杂交检测结果显示肿瘤组织中EB病毒阳性者占27.42%。EB病毒感染与患者年龄相关（Χ2=5.914，p=0.015）；EB病毒阳性组中年龄≧60岁的病例占94.12%（16/17）。其他临床病理参数与EB病毒感染无相关性。
4.临床病理特征之间相关性结果
（1）62例样本中GCB组13例，non-GCB组49例。病理分型与疗效和总生存率（OS）相关。GCB组中治疗有效率（69.23%，9/13）高于治疗无效率（30.77%，4/13），non-GCB组中治疗无效率（75.51%，37/49）高于治疗有效率（24.49%，12/49）；GCB组中OS>1年的比例（84.62%，11/13）显著高于OS≦1年的比例（15.38%，2/13）。其他临床病理特征与病理分型之间无相关性。
（2）62例患者中结内DLBCL40例，结外DLBCL22例。发病部位与患者的临床病理特征无相关性。
（3）根据DLBCL患者疗效判定标准将其分为无效组（SD+PD）和有效组（CR+PR）。62例患者中治疗无效组41例，有效组21例。疗效与Ann Arbor分期、IPI评分、血清LDH水平及病理分型相关。治疗无效组中临床分期高、IPI评分高、血清LDH水平升高以及non-GCB亚型的病例数较多。其他临床病理特征与疗效间无相关性。
5.免疫组化双染法与原位杂交套染结果
先行原位杂交用DAB棕色显色系统，再行免疫组化双染法（先用AEC红色显色系统，再用DAB棕色显色系统）染色效果更好。结果显示在DLBCL中EB病毒阳性细胞主要是肿瘤细胞（B淋巴细胞）。
结论：
1.DLBCL组织中CD3、CD8高表达与IPI低评分相关，提示DLBCL微环境中CD3和CD8阳性T细胞增多是肿瘤预后较好的指标。
2.DLBCL组织中CD4阳性细胞数与临床病理参数无相关性。
3.DLBCL组织中CD163高表达与治疗无效率相关；提示DLBCL微环境中CD163阳性的巨噬细胞增多预示治疗效果不佳。
4.在DLBCL中EB病毒主要感染肿瘤细胞。
5.免疫组化双染法与原位杂交套染技术中先行原位杂交后行免疫组化染色效果更好。