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目的:1、通过脑室内给药的方法给予食源性肥胖大鼠leptin短期和长期干预,探讨中枢给予leptin干预对食源性肥胖大鼠组织自噬的作用及其能量代谢平衡的影响。2、通过体外培养3T3-L1前脂肪细胞后给予leptin和自噬工具药物干预,观察leptin对于3T3-L1前脂肪细胞分化及表型的影响;探究leptin对于3T3-L1前脂肪细胞自噬的作用及机制。方法:1、选取SD大鼠通过给予高脂饲料喂养建立食源性肥胖(diet induced obesity,DIO)动物模型。在喂养过程中监测大鼠体重增长情况,在高脂饲料喂养16周后,将高脂组(high fat diet,HFD)大鼠根据体重进一步分为食源性肥胖组和肥胖抵抗组(diet resistant,DR);普通饲料喂养的大鼠作为对照组(chow feed,CF)。建模期间监测大鼠体重和进食量;使用EILSA试剂盒检测不同组别中SD大鼠的血清leptin水平。2、对SD大鼠通过第三脑室内注射leptin进行短期干预。分别将DIO、DR和CF组大鼠随机分为三组,即:注射leptin的大鼠分为高浓度组(High,H)和低浓度组(Low,L),设立对照组(Control,C)给予人工脑脊液注射。脑室内注射leptin后24 h监测大鼠体重和进食量;使用EILSA试剂盒检测不同组别SD大鼠的血清leptin水平;通过HE染色观察干预后肝脏、脂肪组织的形态变化;通过Western Blot方法检测大鼠中枢(下丘脑)和外周(肝脏组织、脂肪组织)内自噬相关因子LC3B、Beclin-1和P62蛋白水平的表达,观察中枢给予leptin短期干预后大鼠中枢和外周组织的自噬变化;探讨中枢给予leptin短期干预对DIO大鼠中枢及外周组织的自噬及能量代谢的影响。3、对SD大鼠进行侧脑室置管后连续注射leptin一周进行长期干预。分别将CF和DIO和DR组大鼠随机分为两组,即:注射高浓度leptin的大鼠为干预组(High,H),设立对照组(Control,C)给予人工脑脊液注射。在置管成功后,给予各组大鼠连续注射leptin或人工脑脊液干预一周。在干预过程中,每天定时监测大鼠体重和进食量;使用EILSA试剂盒检测不同组别中SD大鼠的血清leptin水平;通过油红O染色和HE染色观察干预后大鼠肝脏、脂肪组织的形态变化;通过Western Blot检测大鼠中枢(下丘脑)和外周(脂肪组织、肝脏组织)内自噬相关因子LC3B、Beclin-1和P62蛋白水平的表达,观察中枢给予leptin蛋白长期干预后大鼠中枢和外周组织的自噬变化。探讨中枢给予leptin长期干预对DIO大鼠中枢及外周组织的自噬及能量代谢的影响。4、体外培养3T3-L1前脂肪细胞并诱导其分化为成熟脂肪细胞,在诱导分化过程中加入leptin干预,通过油红O染色观察leptin对于3T3-L1前脂肪细胞分化及细胞表型的影响;通过RT-PCR检测脂肪细胞分化、甘油三酯合成、分解,脂肪酸β氧化及棕色脂肪特征性基因的mRNA表达水平来探讨leptin对脂肪细胞分化及成脂的影响;在细胞诱导分化的不同阶段给予leptin及自噬工具药(Rapamyin和Bafilomycin A1)干预,检测自噬相关因子LC3B蛋白水平的表达并在免疫荧光显微镜下观察P62的变化,分析leptin干预在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化的不同阶段对其自噬的作用。检测leptin干预后3T3-L1前脂肪细胞自噬及mTOR信号通路相关因子LC3B、P62、Beclin-1、4E-BP1、p-4E-BP1的蛋白水平表达。探讨leptin对脂肪细胞分化及自噬的影响是否通过mTOR依赖的信号通路实现。结果:1、造模成功后,DIO组大鼠的体重和能量摄入均高于CF和DR组大鼠。DIO大鼠血清leptin水平高于CF和DR组,存在leptin抵抗。2、中枢给予leptin短期干预后,CF组大鼠的体重下降,但能量摄入较干预前增多;DIO组体重下降,leptin高浓度组大鼠能量摄入较干预前减少,leptin低浓度组大鼠能量摄入与干预前比较差异无统计学意义。DR组大鼠体重下降,但能量摄入与干预前比较无明显变化。Leptin干预后CF、DIO和DR组大鼠血清leptin水平均下降,但差异无统计学意义。高脂饲料喂养的DIO和DR大鼠存在肝脂肪变性,且DIO大鼠的脂肪细胞体积明显增大,给予leptin干预24h后,肝细胞和脂肪细胞形态无改变。给予高脂饲料喂养的DIO和DR大鼠与普通饲料喂养的CF组大鼠比较,其肝脏组织自噬下调,脂肪组织和下丘脑组织的自噬上调。给予leptin干预后,DIO和DR大鼠的肝脏组织自噬上调,脂肪组织和下丘脑组织自噬下调;CF组大鼠的肝脏组织的自噬下调,脂肪组织和下丘脑组织自噬上调。3、中枢给予leptin长期干预后,CF组大鼠的体重无明显改变,但能量摄入较干预前增多;DIO组大鼠体重下降,其能量摄入波动下降;DR大鼠体重下降,同时能量摄入也减少。Leptin长期干预后,CF、DIO和DR组大鼠血清leptin水平较干预前有所增加,但差异无统计学意义;给予leptin干预一周后,DIO和DR组大鼠肝脏组织脂肪变性得到一定程度改善,DIO组大鼠脂肪细胞体积减小,但CF和DR组脂肪细胞体积没有明显改变。给予leptin干预后,DIO和DR大鼠的肝脏组织自噬上调,脂肪组织和下丘脑组织自噬下调;CF组大鼠的肝脏组织的自噬下调,脂肪组织和下丘脑组织自噬下调。4、Leptin干预后3T3-L1前脂肪细胞形态无改变。在诱导分化过程中给予leptin持续干预,3T3-L1前脂肪细胞成脂率降低。在给予3T3-L1前脂肪细胞诱导分化早期给予leptin干预后PPARγ、HSL mRNA表达量较对照组增高,在细胞分化的晚期干预组的aP2、DGAT1、DGAT2 mRNA表达量降低。给予leptin干预后,UCP1和PGC-1αmRNA增高。5、在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化早期给予leptin干预促进自噬上调,在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化晚期给予leptin干预后细胞自噬下调。在3T3-L1前脂肪细胞分化的早期leptin能增加自噬体的合成,促进自噬体降解,加快3T3-L1前脂肪细胞自噬进程,促进自噬;但在3T3-L1前脂肪细胞分化的中、晚期leptin增加自噬体的合成,但抑制自噬体降解,抑制自噬。Leptin对于3T3-L1前脂肪细胞自噬的调控是通过mTOR依赖的信号通路实现的。结论:1、中枢给予leptin干预后,可以促进DIO、DR大鼠体重下降,能量消耗增加;CF组大鼠能量消耗增加。同时调节大鼠肝脏、脂肪和下丘脑组织自噬,维持能量代谢平衡。2、3T3-L1前脂肪细胞诱导分化时给予leptin干预,细胞形态未改变,但其成脂分化率降低;在细胞诱导分化早期leptin促进3T3-L1前脂肪细胞自噬上调,促进细胞分化;在细胞诱导分化晚期,leptin抑制3T3-L1前脂肪细胞自噬,促进甘油三酯分解,减少脂滴聚集。且leptin对3T3-L1前脂肪细胞自噬的调节通过mTOR依赖的信号通路实现。