研究目的：糖尿病是由于胰岛素抵抗或者胰岛素分泌不足所致的以高血糖为特征的代谢性疾病,可以引起多种并发症。糖尿病脑病是糖尿病最复杂的慢性并发症之一,临床上以认知功能障碍为主要表现,轻者学习记忆能力明显下降、空间定向困难,重者可发展为痴呆。迄今为止,其确切的病理损伤机制依然是迷雾重重,给糖尿病脑病的防治带来很大的困难。因此,深入研究糖尿病脑病的发生机制和防治措施,对提高糖尿病脑病患者生存质量具有重要意义。cAMP反应元件结合蛋白(CREB)是一种真核生物细胞核内调控因子,激活CREB可以增加突触可塑性蛋白、记忆相关蛋白的表达及新的突触生成,在神经元再生、突触形成及学习记忆等方而具有重要的调节作用。Akt/CREB是CREB激活通路中的一种。由于糖尿病状态下,胰岛素信号通路活性下降,首要影响下游的Akt的信号通路。因此很自然想到,糖尿病诱导的认知功能障碍可能是由于海马神经元Akt的活性下降,使得CREB的磷酸化减少,影响多种与记忆有关的靶基因转录,最终导致学习记忆功能障碍。因此,改善Akt/CREB信号通路的活性可能成为治疗糖尿病脑病有效靶点。多甲氧基黄酮(PMFs)是一类富含甲氧基的酚类化合物,广泛的存在自然界中。现有研究发现PMFs具有广泛的药理作用,如改善胰岛素抵抗,抗炎,抗氧化,改善认知功能障碍,可作为防治糖尿病诱导的认知功能障碍的候选药物。五甲基槲皮素(PMQ)是典型的多甲氧基黄酮类化合物,从结构式上可以推断也应该有上述功能。然而迄今为止,有关PMQ改善糖尿病诱导的认知功能障碍的研究还未见报道。有鉴于此,本课题通过采用自发性2型糖尿病GK大鼠和新生鼠STZ诱导的糖尿病大鼠模型,研究认知功能、海马神经元树突棘形态学及Akt/CREB信号通路在糖尿病大鼠中的改变,探讨Akt/CREB信号通路在糖尿病所致的海马神经元损伤和学习记忆功能障碍中的作用。同时,本课题也通过PMQ治疗自发性2型糖尿病GK大鼠,干预高糖诱导的海马神经元损伤,探讨PMQ保护糖尿病诱导的脑损伤的机制。研究方法：1、选择雄性新出生2天后的乳鼠,腹腔注射STZ (90mg/kg),对照组给以等体积生理盐水注射,在4周龄时,按空腹血糖随机分为对照组(SD组)和STZ处理组(STZ组),每组12只,连续喂养29周。12周龄雄性GK大鼠,12只,12周龄雄性Wistar大鼠,9只,常规饲料喂养20周。大鼠自由进食饮水,每天常规观察两次,每周定时称量大鼠体重,每天称量水食消耗,于32周龄做水迷宫实验,实验后检测大鼠空腹血糖,血清胰岛素水平,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。取大鼠海马组织,一部分做尼氏染色、高尔基染色及免疫组化等形态学实验。一部分做Western blot实验分析Akt、CREB、SYP和BDNF蛋白表达。2、GK大鼠适应性喂养约4周后,按照空腹血糖随机分成：GK正常饲料组(GK组,n=12),GK+含PMQ饲料给药组(PMQ2.5、5、10mg/kg, n=8), GK(?)含二甲双胍饲料300mg/kg/d (MET组,n=12),以及Wistar正常饲料组(Wistar组,n=9)共6组,GK组和Wistar组的大鼠给予正常饲料喂养,其它组的大鼠分别给予相应含药饲料。记录每周大鼠的饮食、饮水及体重。于给药后第16周进行Morris水迷宫测试。水迷宫实验后检钡OGTT、大鼠空腹血糖、血清胰岛素水平,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);取大鼠海马组织,一部分做尼氏染色、高尔基染色及免疫组化等形态学实验。一部分做Western blot分析Akt、CREB、SYP和GluR1蛋白表达。3、成熟的神经元细胞加入不同浓度的葡萄糖(50、75、100、125mM)分别诱导24、48、72和96小时后。每孔加入20μlMTT工作液,孵育4h后,弃去各孔培养基,每孔加入200μl DMSO溶解。酶标仪570nm检测各孔吸光度值。选择诱导72小时使海马神经元活力下降到50%左右的葡萄糖浓度,作为最佳葡萄糖浓度和最佳作用时间,用于后续实验。实验分组如下：正培养液组,甘露醇组,最佳高糖组,最佳高糖+溶剂组,最佳高糖+PMQ(0.1、0.3、1、3、10μM)组,最佳高糖+PMQ (1μM)+LY294002(50μM)组。培养72小时后,MTT检测细胞活力,Western blot分析Akt、CREB、SYP和GluRl蛋白表达。实验结果：1.与正常Wistar和SD大鼠相比,32周龄的GK和STZ大鼠出现严重的高血糖、高胰岛素血症和高胰岛素抵抗指数,并伴有体重获得减少和水食消耗增加,同时在Morris水迷宫实验中,GK和STZ大鼠潜逃时间显著地延长,在目标象限逗留的时间百分比明显缩短。而且胰岛素抵抗指数越高,潜逃时间越长。在可见目标平台的实验中,GK和STZ大鼠潜逃时间无显著性改变,而且,游泳速度没有差异性。GK和STZ大鼠海马CA1区神经元细胞排列稀疏,细胞形态模糊,正常形态细胞明显减少,细胞活力显著降低,树突棘的密度也显著减少,长度变化不明显。而且GK和STZ大鼠海马神经元活力及树突棘密度与血糖浓度成负相关。同时,GK和STZ大鼠海马神经元p-Akt (Ser473). p-CREB (Ser133)、SYP和BDNF蛋白的表达均出现显著下调,总的Akt和CREB蛋白表达无明显改变。2.PMQ能够改善GK大鼠食水摄取指数,降低餐后血糖,降低空腹胰岛素水平。同时,PMQ也能改善葡萄糖耐量受损,提高胰岛素的敏感性,且呈一定的剂量依赖性,与GK组比较,具有显著性差异。PMQ干预能够显著缩短潜逃时间和游泳距离,同时增加在目标现象停留时间的百分比例,呈现一定的剂量依赖性,PMQ10mg/kg作用尤为明显。而且胰岛素抵抗指数越小,潜逃时间越短。PMQ干预后GK大鼠海马CA1区神经元细胞排列紧密,细胞形态清晰,正常形态细胞明显增多,细胞活力显著增加,树突棘的密度也显著增加。同时上调P-Akt、P-CREB、SYP和GluRl的蛋白表达。3.海马神经元细胞成熟后,在24h之内不同浓度的高糖处理,对神经元细胞活力及数量无显著影响,处理48h,50mM和75mM高糖组细胞活力下降,但无统计学意义,100mM和125mM的高糖组细胞活力下降出现显著性差异,处理72h,100mM的高糖使细胞活力下降到58.8%。而100mM的甘露醇处理对细胞活力无明显影响。PMQ干预高糖处理海马神经元后,神经元细胞活力和数量增加,呈现剂量依赖性,PMQ1μM时,作用达到平台,增加浓度,作用不再增加。LY294002干预后,可部分抵消PMQ的保护作用。同时,PMQ可以增加海马神经元p-Akt、p-CREB、SYP和GluRl蛋白的表达,但对Akt和CREB,总的蛋白表达无明显影响,LY294002干预后,p-Akt、p-CREB、SYP和GluRl蛋白的表达上调不明显,部分抵消了PMQ的作用。实验结论：1.糖尿病大鼠出现了认知功能障碍、海马神经元损伤及树突棘密度减少,其程度与胰岛素抵抗呈正相关。2.海马神经元细胞存活信号转导通路Akt/CREB活性降低在糖尿病认知功能障碍中起关键作用。3.PMQ能够改善糖尿病认知功能障碍,保护海马神经元,其作用机制部分是通过激活Akt/CREB信号通路来实现的。