目的:铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是常见医院获得性感染条件致病菌,常在机体免疫力低下,囊性纤维化,大量使用抗生素等人群中引起各种急慢性感染,且病情迁延难治[1]。PA与宿主免疫细胞相互作用介导免疫逃逸是PA致病的重要方式。树突细胞（dendritic cells,DCs）是人体专职的抗原递呈细胞（Antigen presenting cells,APC）[2],能摄取、加工及提呈抗原,刺激辅助性T细胞（T Helper cells,Th）的增殖与极化,是启动、调控、维持Th细胞免疫应答的中心环节[3]。DCs与外来抗原相互作用后,将外来抗原加工处理形成MHCII-抗原肽复合物提呈给Th细胞,提供Th细胞活化的第一信号。同时,DCs表达的协同刺激分子CD40和B7（CD80、CD86）,与Th细胞表面的CD40L和CD28结合,提供Th细胞活化第二信号。另外,DCs分泌的细胞因子提供Th细胞活化第三信号,多种信号共同调节Th细胞极化。在各种病理条件下,如慢性感染,病原菌通过抑制DCs表面信号分子和细胞因子的表达而阻碍DCs成熟,使DCs逐渐被"驯化"成具有免疫抑制功能的DCs,导致Th细胞极化为抑制性T细胞（如Th2细胞和调节性T细胞）,导致病情进展和反复发作[3]。因此,深入了解PA对DCs成熟的影响有助于理解Th细胞极化机制,从而揭示PA免疫逃逸的机理。N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(N-3-Oxododecanoyl-L-homoserine lactone,3-O-C₁₂-HSL)是PA群体密度感应（Quorum Sensing,QS）系统分泌的一种重要的病原体相关分子模式（Pathogen associated molecular patterns,PAMPs）[4],可调节细菌耐药、毒力基因的表达和宿主免疫功能。3-O-C₁₂-HSL是一种脂溶性小分子物质,具有膜通透性,在PA致病过程中,可自由扩散直接通过细胞膜进入宿主细胞内,调节宿主功能[5]。陆续有研究表明信号分子3-O-C₁₂-HSL可调节中性粒细胞[6]、淋巴细胞[7]和巨噬细胞[8]等多种免疫细胞的功能,影响机体的免疫防御能力。我们前期证实3-O-C₁₂-HSL调节人单核细胞衍生树突细胞（Monocytes derived dendritic cells,Mo-DCs）的成熟与功能。我们发现:第一,3-O-C₁₂-HSL下调LPS诱导的人Mo-DCs表面分子CD40、CD80和HLA-DR表达水平,促进Mo-DCs分泌IL-10,抑制Mo-DCs分泌IL-12[9,10]。第二,3-O-C₁₂-HSL处理的Mo-DCs抑制CD4+Th细胞增殖,促进CD4+Th细胞分泌IL-4,抑制IL-12和IFN-γ的分泌,表明3-O-C₁₂-HSL通过Mo-DCs促进CD4+T细胞向Th2方向极性分化[9]。第三,3-O-C₁₂-HSL通过Mo-DCs促进CD4+Th细胞分泌IL-10和TGF-β,3-O-C₁₂-HSL通过Mo-DCs促进CD4+T细胞向CD4+CD25+Foxp3+ Tregs方向极性分化[10]。前期研究结果表明3-O-C₁₂-HSL通过阻碍Mo-DCs成熟影响CD4+1细胞极性分化,参与免疫逃逸,但3-O-C₁₂-HSL阻碍Mo-DCs成熟的相关分子机制尚不完全清楚。近期,Cooley[11]等以人支气管上皮细胞为细胞模型,发现3-O-C₁₂-HSL干扰过氧化物酶增殖物激活受体 γ（peroxisomeproliferater-activated receptorγ,PPAR γ）与其配体罗格列酮（Rosiglitazone,ROS）的结合,提示3-O-C₁₂-HSL可能与PPAR γ相结合。另外,在Mo-DCs中,PPAR丫与配体结合引起的生物学效应与3-O-C₁₂-HSL对Mo-DCs的调节作用相一致[12]。为此,我们认为在Mo-DCs中,3-O-C₁₂-HSL通过与PPARγ相结合而激活PPAR γ,进而通过PPAR γ下游信号通路调节信号分子表达水平,阻碍Mo-DCs成熟并调节Th细胞极化。DCs的成熟状态和功能与众多基因的表达水平和细胞增殖分化密切相关[13],而长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）可在转录及转录后水平调控基因表达,调节细胞的增殖与分化[14]。因此,不难推测lncRNA能调控DCs的成熟与功能。为此,我们研究了 3-O-C₁₂-HSL阻碍Mo-DCs成熟过程中lncRNA表达谱的变化情况,以lncRNA lnc-DC为候选lnc-RNA,探讨了 3-O-C₁₂-HSL对lncRNA lnc-DC表达水平的调节作用是否由PPAR γ介导。总之,本研究探讨了PPAR γ与lncRNA在3-O-C₁₂-HSL阻碍Mo-DCs成熟中的作用。本课题的研究意义在于从PA与宿主免疫细胞相互作用的角度阐明PA免疫逃逸的相关机制,进一步丰富PA的致病机理,为PA感染的预防和治疗提供新思路。方法:1.配体筛选实验检测3-O-C₁₂-HSL与PPAR γ直接结合。将荧光标记的PPAR γ天然配体和PPAR γ混合后加入不同浓度的3-O-C₁₂-HSL样品,检测各组的偏振光值。2.检测 3-O-C₁₂-HSL 对 Mo-DCs 中 PPAR γ mRNA 的影响。3-O-C₁₂-HSL 处理 Mo-DCs,荧光定量PCR技术检测PPAR γ mRNA的表达水平。3.检测3-O-C₁₂-HSL通过PPAR γ对Mo-DCs成熟的影响。用PPAR γ的特异性拮抗剂GW9662处理Mo-DCs,再用3-O-C₁₂-HSL处理Mo-DCs。流式细胞术检测Mo-DCs的吞噬能力和表面分子CDla,CD40,CD83,HLA-DR和CD80表达水平。酶联免疫吸附实验和电化学发光法检测Mo-DCs培养上清的细胞因子IL-10、IL-12和IL-6浓度。4.检测3-O-C₁₂-HSL通过PPAR 丫对Mo-DCs功能的影响。用PPAR γ的特异性拮抗剂GW9662处理Mo-DCs后加入3-O-C₁₂-HSL,处理的Mo-DCs与CSFE标记的CD4+Th细胞共培养,流式细胞术检测CD4+Th细胞的增殖,酶联免疫吸附实验检测混合培养上清中细胞因子IFN-γ和IL-4表达水平。5.检测3-O-C₁₂-HSL通过PPAR γ对Mo-DCs中JNK MAPK信号通路的影响。用PPARγ的特异性拮抗剂GW9662处理Mo-DCs,再加入3-O-C₁₂-HSL。免疫迹印实验检测JNK1/2和p-JNK1/2表达水平。6.检测3-O-C₁₂-HSL阻碍Mo-DCs成熟过程中lncRNA表达谱的变化。用lncRNA基因芯片检测了 3-O-C₁₂-HSL处理后Mo-DCs中lncRNA,通过生物信息学技术对差异lncRNA进行聚类分析。荧光定量PCR技术鉴定候选lncRNA lnc-DC的表达水平。7.检测候选lncRNA lnc-DC表达水平是否由PPAR γ介导。用PPAR γ的特异性拮抗剂GW9662处理Mo-DCs后加入3-O-C₁₂-HSL,定量PCR技术检测lnc-DC表达水平。8.预测lncRNA lnc-DC启动子区域结合的转录因子,荧光定量PCR技术检测C-Fos和C-Jun的mRNA表达水平是否由PPAR γ介导。用PPAR γ特异性拮抗剂GW9662处理Mo-DCs后加入3-O-C₁₂-HSL,定量PCR技术检测C-Fos和C-Jun的mRNA表达水平。结果:1.配体筛选实验显示3-O-C₁₂-HSL大于4.60 μ mol/L时竞争性结合PPAR γ配体结合区。2.荧光定量PCR实验发现3-O-C₁₂-HSL下调LPS处理的Mo-DCs中PPAR γ mRNA的表达。3.3-O-C₁₂-HSL 下调 LPS 诱导的 Mo-DCs 表面 CD40,CD83,HLA-DR 和 CD80 表达水平。与3-O-C₁₂-HSL实验组相比,GW9662能部分逆转CD40和CD83表达水平,CD1a、CD80 和 HLA-DR 无统计学差异。3-O-C₁₂-HSL 抑制 Mo-DCs 表达 IL-6 和 IL-12,促进Mo-DCs表达IL-10。GW9662能部分逆转3-O-C₁₂-HSL抑制Mo-DCs表达IL-6,未能逆转3-O-C₁₂-HSL 对 Mo-DCs 表达 IL-12 和 IL-10。4.3-O-C₁₂-HSL下调LPS诱导的Mo-DCs抗原吞噬能力,GW9662能部分逆转3-O-C₁₂-HSL介导的抗原吞噬能力下调。3-O-C₁₂-HSL处理的Mo-DCs下调CD4+Th细胞的增殖。GW9662未能恢复3-O-C₁₂-HSL通过Mo-DCs对CD4+Th细胞的增殖的下调作用。3-O-C₁₂-HSL处理的Mo-DCs抑制CD4+Th细胞表达IFN-γ,促进CD4+Th细胞表达IL-4。GW9662能部分逆转3-O-C₁₂-HSL通过Mo-DCs抑制CD4+Th细胞表达IL-4。GW9662能部分恢复3-O-C₁₂-HSL通过Mo-DCs促进CD4+Th细胞表达IFN-γ。5.3-O-C₁₂-HSL下调LPS诱导的Mo-DCs中p-JNK1/2表达水平,GW9662部分逆转3-O-C₁₂-HSL 抑制 Mo-DCs 中 p-JNK1/2 的表达水平。6.与LPS模型组相比较,3-O-C₁₂-HSL实验组筛选出2倍以上表达差异的lncRNA有1386条,其中548条表达上调,838条表达下调。表达差异5倍以上lncRNA共153条,其中22条表达上调,131条表达下调。散点图发现2倍表达差异的lncRNA总体分布呈集中趋势。聚类分析发现5倍表达差异的lncRNA能根据处理因素进行有效的分层聚类。7.lncRNA基因芯片筛选实验中,3-O-C₁₂-HSL下调LPS诱导的Mo-DCs中lnc-DC的表达水平。荧光定量PCR实验发现,LPS诱导后,lnc-DC表达水平显著上调（19.6倍）。在此基础上,添加5 u mol/L、10 μ mol/L和25 μ mol/L的3-O-C₁₂-HSL处理后,lnc-DC的表达水平受到抑制（分别下调0.64倍、0.61倍和0.50倍）。进一步添加GW9662又能部分逆转3-O-C₁₂-HSL对lnc-DC表达的抑制作用。8.3-O-C₁₂-HSL下调Mo-DCs中C-Fos和C-Jun的mRNA表达水平,其作用方式依赖于PPAR γ,提示3-O-C₁₂-HSL可能通过C-Fos和C-Jun调节lnc-DC表达水平。结论:1.3-O-C₁₂-HSL直接与PPAR γ相结合,下调PPARγmRNA表达水平。2.3-O-C₁₂-HSL通过PPAR γ部分调节Mo-DCs的成熟与功能。3.3-O-C₁₂-HSL作用于Mo-DCs后,lncRNA表达谱发生特征性变化。4.3-O-C₁₂-HSL下调lncRNA lnc-DC表达,其作用方式依赖于PPARγ。5.3-O-C₁₂-HSL下调C-Fos和C-Jun的mRNA表达水平,其作用方式依赖于PPAR-γ。