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肝纤维化是一种由多种病因导致的慢性肝脏疾病,包括病毒感染,酒精性肝病,非酒精性脂肪性肝炎及日本血吸虫感染等,表现为分泌大量促炎、促纤维化细胞因子导致肝内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积,进而逐渐形成肝纤维化。日本血吸虫性肝纤维化的主要致病机制是由肝脏和肠等组织内的虫卵引起虫卵肉芽肿改变及继发性肝纤维化。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是肝纤维化的细胞学基础,是肝纤维化的主要效应细胞,其活化增殖是肝纤维化形成的初始条件。HSCs的活化和增殖在日本血吸虫性肝纤维化的发生发展过程中发挥关键作用。研究表明,HSCs的活化过程涉及多种细胞因子及细胞信号转导通路,其中TGF-β1/Smad信号通路是HSCs活化过程中最经典的通路之一,近年来研究的比较深入。然而这条信号通路在日本血吸虫感染宿主致肝纤维化过程中的调控机制尚有待进一步深入阐明。课题组前期研究在mRNA水平上已表明,ICOSL/ICOS信号可调控TGF-β1/Smad信号通路对HSCs活化介导肝脏纤维化的形成。本课题研究应用ICOS转基因(ICOS transgenosis,ICOS-Tg)小鼠及其野生型FVB/NJ小鼠建立日本血吸虫性肝纤维化实验动物模型,在蛋白水平上,探讨ICOS-Tg小鼠日本血吸虫性肝纤维化疾病模型中,TGF-β1/Smad信号通路对HSCs活化的影响,深入阐明该通路中各信号分子的作用,明确调控HSCs活化的关键分子靶蛋白,为寻找可调节HSCs活化及控制肝纤维化的发生发展的免疫卡控点提供科学依据。第一部分日本血吸虫感染后小鼠体内肝星状细胞的提取、鉴定及培养目的:日本血吸虫感染后小鼠体内原代HSCs的提取、鉴定及培养,获得存活率及纯度均符合后续实验要求的HSCs。方法:首先使用ICOS-Tg小鼠及其野生型FVB/NJ小鼠建立日本血吸虫性肝纤维化实验动物模型。然后通过肝脏原位酶灌注法和OptiPrep密度梯度离心法,提取对照组(OW)、肉芽肿形成早期(4W)、急性肉芽肿期(7W)和肝纤维化形成早期(9W)四个不同病期小鼠体内的原代HSCs。最后采用牛鲍计数板计数新鲜提取的原代HSCs并通过台盼蓝染色法鉴定其存活率;采用两种经典方法鉴定原代HSCs的纯度,分别是:(1)在328nm波长的紫外激发光下,观察原代HSCs自发荧光情况;(2)培养3天后的原代HSCs进行神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色。结果:(1)小鼠原代HSCs在培养过程中,生长良好,变形明显。新鲜提取的原代HSCs,每只小鼠的细胞数量平均为(2.45±0.3)×106个,存活率在95%以上。(2)使用倒置荧光显微镜在328nm波长的紫外激发光下,观察新鲜提取的小鼠原代HSCs,在胞质内能看到蓝绿色荧光。(3)GFAP免疫细胞化学染色,胞质中观察到红色荧光,且纯度达到90%以上。结论:提取的小鼠原代HSCs存活率及纯度均达到90%以上,成功获取高质量的细胞标本。第二部分日本血吸虫感染ICOS-Tg小鼠慢性致病期HSCs中促纤维化分子mRNA及蛋白表达水平的动态变化目的:探讨ICOS-Tg小鼠及其野生型FVB/NJ小鼠日本血吸虫性肝纤维化模型中,其慢性致病期原代HSCs的活化程度及与胶原分泌相关mRNA及蛋白表达水平的动态变化。方法:在不同感染周期,收集培养7天后的原代HSCs。提取细胞内总RNA和总蛋白,分别应用荧光定量PCR技术和Western Blotting技术,检测ICOS-Tg小鼠及其野生型 FVB/NJ 小鼠原代 HSCs 中α-SMA、Collagen type Ⅰ和Collagen typeⅢ的mRNA及蛋白表达水平,分析比较三个指标在日本血吸虫性肝纤维化慢性致病期中的动态变化。结果:随着感染后病程的延长,原代HSCs中α-SMA、Collagentype Ⅰ和Collagen type Ⅲ的mRNA及蛋白表达水平均不断升高。mRNA表达水平在肉芽肿形成早期(4W)开始升高,急性肉芽肿期(7W)和肝纤维化形成早期(9W)呈快速升高趋势。蛋白表达水平在肉芽肿形成早期(4W)开始升高,急性肉芽肿期(7W)和肝纤维化形成早期(9W)呈缓慢升高趋势。与同时期对照组FVB/NJ小鼠相比,ICOS-Tg 小鼠原代 HSCs 中 α-SMA、Collagen type Ⅰ和 Collagen type Ⅲ的 mRNA及蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01或P<0.001),且mRNA转录水平与蛋白翻译水平的变化趋势保持一致。结论:在日本血吸虫性肝纤维化慢性致病期,HSCs始终保持活化状态。与同时期对照组FVB/NJ小鼠相比,ICOS-Tg小鼠日本血吸虫疾病模型中小鼠ICOSL/ICOS信号显著上调,并促进HSCs的活化及肝内胶原的生成。其中α-SMA分子的mRNA及蛋白表达水平上调的最为显著(P<0.05或P<0.001),提示通过干预ICOSL/ICOS信号可能是调节肝纤维化的发生发展的重要免疫卡控点。第三部分ICOSL/ICOS调控TGF-β1/Smad信号通路活化HSCs介导肝纤维化的分子机制目的:探讨共刺激信号ICOSL/ICOS的上调,对ICOS-Tg小鼠及其野生型FVB/NJ小鼠感染日本血吸虫后,原代HSCs中活化TGF-β1/Smad信号通路中各蛋白分子的影响。方法:应用贝博总蛋白提取试剂盒提取培养7天后原代HSCs内总蛋白,应用Western Blotting技术检测ICOS-Tg小鼠及其野生型FVB/NJ小鼠原代HSCs中TGF-β1、pSmad2/3、Smad2/3、Smad4和Smad7蛋白的表达水平,分析比较两种小鼠各蛋白表达水平的动态变化。结果:日本血吸虫感染小鼠后,随着病程的发展,TGF-β1/Smad信号通路中,TGF-β1蛋白的表达水平在肉芽肿形成早期(4W)开始上升,急性肉芽肿期(7W)和肝纤维化形成早期(9W)逐渐升高,与同时期对照组FVB/NJ小鼠相比,ICOS-Tg小鼠原代HSCs中TGF-β1蛋白的表达水平显著升高(P<0.05或P<0.001);而pSmad2/3、Smad2/3和Smad4蛋白的表达水平在肉芽肿形成早期(4W)开始上升,急性肉芽肿期(7W)达到峰值,肝纤维化形成早期(9W)开始下降,与同时期对照组 FVB/NJ 小鼠比较,ICOS-Tg 小鼠原代 HSCs 中 pSmad2/3、Smad2/3 和 Smad4蛋白的表达水平显著升高(P<0.01或P<0.001);在疾病进展过程中,原代HSCs中Smad7蛋白表达水平仅在肉芽肿形成早期(4W)短暂上升,急性肉芽肿期(7W)开始下降,肝纤维化形成早期(9W)下降到较低水平,与同时期对照组FVB/NJ小鼠比较,ICOS-Tg小鼠原代HSCs中Smad7蛋白的表达水平显著下降(P<0.01或 P<0.001)。结论:在ICOS-Tg小鼠日本血吸虫疾病模型中,随着感染后的免疫病理进程,ICOSL/ICOS的上调,导致TGF-β1/Smad信号通路中TGF-β1蛋白和Smad2/3蛋白表达显著升高,而Smad7蛋白表达则显著下降,提示ICOSL/ICOS信号影响小鼠肝纤维化进程可能是通过调控TGF-β1/Smad信号活化HSCs中的促/抑纤维化因子而发挥作用。