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牛白血病病毒（bovineleukemia virus,BLV）属于反转录病毒科（Retroviridae）,是地方流行性牛白血病（enzootic bovine leukosis,EBL）的病原,主要感染普通牛、瘤牛和水牛。BLV感染后宿主会终生带毒,引发其免疫系统失调和免疫应答能力降低,从而增加了其感染其他病原体的风险。除此之外,BLV的感染还会导致奶牛和肉牛生产性能下降、治疗和预防疾病成本增加、出口受限等,给养牛业造成重大经济损失。截至目前,世界上还没有可用于牛的商品化BLV疫苗,并且仍然缺乏经济的BLV防控和净化策略。因此,本研究建立了 BLV反向遗传学操作系统,并基于此构建了两株具有表型差异的BLV感染性克隆。进一步,通过定点突变、同源重组、间接免疫荧光（indirectimmunofluorescentassay,IFA）、合胞体形成试验、RT-FRET-qPCR、反转录酶活性检测等方法对两株拯救病毒的生物学特性进行研究。主要研究内容和研究结果如下:1.BLV全长感染性克隆的构建根据GenBank已公布的BLV前病毒全基因组DNA序列（Accession number:AB987702、MH170030、LC080656）设计了 4对引物,对本实验室保存的BLV17985株、BLV2723株进行前病毒基因组的分段扩增。依次利用融合PCR（overlap PCR）与同源重组,将分段扩增的BLV前病毒基因组核酸片段克隆到pCAGGS载体,分别命名为pCAGGS-BLV17985与pCAGGS-BLV2723。测序结果显示,重组质粒携带BLV前病毒基因组全长序列（8739 bp）,包括长末端重复序列（long terminal repeat,LTR）（1-528bp,8212-8739bp）,结构基因 env（4828-6375bp）、gag（631-1812bp）、pol（2324-4882bp）、pro（1806-2345bp）以及非结构基因 tax（4875-4878bp,7269-8194 bp）、rex（4828-4878bp,7269-7688bp）、G4（433-505 bp,7088-7332bp）、R3（4828-4878 bp,7040-7123 bp）组成,符合BLV前病毒基因组的结构特征。2.重组病毒的拯救鉴定及动物感染试验将pCAGGS-BLV17985转染HeLa、MDBK、Tb 1 Lu、Vero四种细胞进行合胞体形成试验;进一步利用IFA观测Vero与Tb 1 Lu细胞中BLV-p24抗原的表达情况。随后在Tb 1 Lu细胞上进行病毒的拯救与传代,通过IFA与RT-FRET-qPCR监测拯救病毒在此细胞系上的稳定性以及测定其反转录酶活性。在动物感染试验中,取相同拷贝数的rBLV17985与野毒分别接种绵羊,通过FRET-qPCR监测病毒在绵羊体内的复制情况;分离绵羊外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）与空白Tb1 Lu共培养证实感染情况;使用采集的绵羊血清作为IFA一抗,检测绵羊体内病毒抗体的形成情况。结果表明,构建的pCAGGS-BLV17985可以在Tb 1 Lu细胞上成功拯救出在体外与体内复制的病毒,且拯救病毒在绵羊体内的生物学特性与野毒相近。3.rBLV17985株与rBLV2723株的生物学特性研究在前述研究中曾使用与pCAGGS-BLV17985相同的构建方法,构建了另外一株BLV2723的感染性克隆pCAGGS-BLV2723。在验证拯救病毒稳定性时发现,rBLV17985和rBLV2723在体外的复制能力存在显著差异。通过测序发现rBLV17985和rBLV2723的前病毒全基因组共存在3处突变,均位于pol基因,分别为A2898G、C3072T、T4094C,对应的突变氨基酸分别为Q966R、T1024I、S1365P。为探究调控病毒复制能力的关键氨基酸位点,利用定点突变与同源重组技术分别构建rBLV17985和rBLV2723三个核苷酸位点的突变重组病毒,命名为rBLV17985-Q966R、rBLV17985-T1024I、rBLV17985-S1365P、rBLV2723-R966Q、rBLV2723-I1024T、rBLV2723-P1365S,并在Tb 1 Lu细胞中连续传代。通过反转录酶活性测定、RT-FRET-qPCR和IFA检测,结果显示,与rBLV17985相比,重组病毒rBLV17985-Q966R的体外复制能力无显著差异,而重组病毒rBLV2723与其余突变重组病毒的体外复制能力显著降低。因此,1024和1365是调控病毒复制的关键氨基酸位点,同时为T、S时病毒的复制能力正常,其中任一氨基酸发生突变将导致BLV无法在体外有效复制。本研究构建了 BLV的感染性克隆,并进行了病毒的拯救与鉴定,这是国内首次成功建立的BLV反向遗传学操作系统。进一步分析了两株具有表型差异的病毒的生物学特性,发现调控病毒复制的关键氨基酸位点。我们的研究为BLV的基础研究提供了良好的平台。