目的:　　观察昆明山海棠配伍益母草（昆母）不同提取物对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-HFLS)增殖的抑制作用，了解其对RA-HFLS的细胞周期、细胞凋亡及血管内皮生长因子(VEGF) mRNA表达水平的影响，从cyclin D1、bcl-2、bax及caspase-3基因水平探讨其作用于细胞周期及细胞凋亡的可能机制。同时观察昆母对丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路蛋白磷酸化的影响，探讨其可能的作用机制。　　方法:　　利用3-5代RA-HFLS为研究对象，分别给予昆母乙酸乙酯提取物、昆母氯仿提取物、昆母石油醚提取物及昆母正丁醇提取物处理24h、48h及72h，以CCK-8检测各提取物对RA-HFLS的生长抑制率，流式细胞仪检测24h各组的细胞周期及凋亡率;昆母乙酸乙酯提取物及氯仿提取物处理24h，利用qPCR检测Cyclin D1、VEGF、bcl-2、bax及caspase-3表达水平，应用western bolt检测各组ERK、pERK、JNK、pJNK、P38及pP38蛋白水平。　　结果:　　1.昆母各提取物对RA-HFLS增殖的抑制作用　　(1)昆母乙酸乙酯提取物:与零加药组比较，高剂量组能抑制24h的细胞增殖（P＜0.05)，而MTX组及所有提取物组均可抑制48h及72h的增殖（均P＜0.01）。低剂量组48h的细胞增殖与MTX组相当（P＞0.05），而中、高剂量组则比MTX组更强（均P＜0.01）。与MTX组比较，低剂量组72h的抑制作用偏弱，而中、高剂量组则更强(均P＜0.01)。　　(2)昆母氯仿提取物:与零加药组比较，24h各组均不能抑制RA-HFLS增殖，而高剂量组抑制率稍高（P＞0.05）;48h及72h各组均能显著抑制细胞增殖（均P＜0.01）。与MTX组比较，低剂量组48h的抑制作用相当(P＞0.05)，72h偏弱（P＜0.01），而中高剂量组48h及72h的抑制作用则更强（均P＜0.01）。　　(3)昆母石油醚提取物:与零加药组比较，24h各组均不能抑制RA-HFLS增殖，而高剂量组抑制率稍高(P＞0.05);48h及72h各组均能显著抑制细胞增殖（均P＜0.01）。与MTX组比较，低剂量组48h的抑制作用相当(P＞0.05)，72h偏弱（P＜0.01），而中高剂量组48h及72h的抑制作用则更强（均P＜0.01)。　　(4)昆母正丁醇提取物:与零加药组比较，24h各组均不能抑制RA-HFLS增殖，而高剂量组抑制率稍高(P＞0.05);48h及72h各组均能显著抑制细胞增殖（均P＜0.01)。与MTX组比较，低剂量组48h的抑制作用相当(P＞0.05)，低剂量组72h的抑制作用偏低（P＜0.05），而中高剂量组48h及72h的抑制作用则更强（均P＜0.01）。　　(5)相同浓度的昆母各提取物对RA-HFLS的抑制作用，时间越长，抑制作用越强，抑制率越高;相同作用时间点，药物浓度越高，对成纤维样滑膜细胞的抑制作用越强，抑制率越高。昆母各提取物对成纤维样滑膜细胞增殖的抑制作用，呈时间和剂量依赖性。　　2.昆母提取物对RA-HFLS细胞周期的影响　　干预24h，每组均与空白组比较G1期及PI。昆母氯仿、乙酸乙酯及石油醚提取物低剂量组G1期及PI均无变化（均P＞0.05）。中高剂量组G1期明显升高，PI明显降低（均P＜0.01）。昆母正丁醇提取物低、中、高剂量组G1期明显升高，PI明显降低（均P＜0.01）。　　3.昆母提取物对RA-HFLS凋亡的影响　　干预24h后，每组均与空白组比较。MTX组凋亡率明显升高（P＜0.01);氯仿及石油醚提取物低剂量组凋亡率无变化（均P＞0.05）;乙酸乙酯及正丁醇提取物低剂量组凋亡率升高（分别P＜0.05、P＜0.01）;各提取物中、高剂量组凋亡率均明显升高(均P＜0.01)。　　每组均与MTX组比较。所有提取物低剂量组凋亡率均偏低（均P＜0.01）;氯仿、乙酸乙酯及正丁醇提取物中剂量组相当(均P＞0.05）;石油醚提取物中剂量组凋亡率偏低（P＜0.01））。昆母各提取物高剂量组凋亡率均偏高（均P＜0.01）。　　4.昆母提取物对RA-HFLS血管内皮生长因子(VEGF)、细胞周期蛋白D1、Bax、bcl-2及caspase-3的影响　　(1)氯仿及乙酸乙酯提取物对VEGF表达的影响　　qPCR显示，与未加TNF-α组比较，TNF-α组VEGF表达升高(P＜0.05)。与TNF-α组比较，MTX组（P＜0.05)、乙酸乙酯提取物高剂量组及所有氯仿提取物组（均P＜0.01）表达下降，乙酸乙酯提取物低剂量及中剂量组无变化（均P＞0.05）。与MTX组比较，乙酸乙酯提取物低剂量组VEGF表达稍高（P＜0.05)，乙酸乙酯提取物中剂量组及氯仿提取物低剂量组当(均P＞0.05），乙酸乙酯提取物高剂量组及氯仿提取物中、高剂量组偏高（均P＜0.01）。　　(2)氯仿及乙酸乙酯提取物对cyclin D1表达的影响　　qPCR显示，与未加TNF-α组比较，TNF-α组cyclin D1水平明显升高（P＜0.01)，与TNF-α组比较，MTX组、乙酸乙酯各组及氯仿中、高剂量组cyclin D1明显降低（均P＜0.01），昆母氯仿低剂量组cyclin D1水平变化不明显（P＞0.05）。与MTX组比较，乙酸乙酯（P＜0.05）及氯仿（P＜0.01)低剂量组cyclin D1水平偏高，乙酸乙酯中剂量组及氯仿中、高剂量组cyclin D1相当（均P＞0.05），而乙酸乙酯高剂量组cyclinD1水平则显著降低(P＜0.01)。　　(3)氯仿及乙酸乙酯提取物对bcl-2表达的影响　　qPCR显示，与未加TNF-α组比较，TNF-α组bcl-2水平明显升高（P＜0.01）。与TNF-α组比较，MTX组、乙酸乙酯及氯仿中、高剂量组bcl-2水平明显降低（P＜0.01)，昆母氯仿低、中剂量组无变化（均P＞0.05）。与MTX组比较，昆母乙酸乙酯及氯仿低剂量组bcl-2水平偏高（均P＜0.01），乙酸乙酯及氯仿中剂量组bcl-2变化不明显（均P＞0.05），乙酸乙酯（P＜0.01）及氯仿（P＜0.05）高剂量组bcl-2水平则显著降低。　　(4)氯仿及乙酸乙酯提取物对bax表达的影响　　qPCR显示，与未加TNF-α组比较，TNF-Ⅱ组bax水平降低（P＜0.05）。与TNF-α组比较，各组bax表达水平明显升高（均P＜0.01）。与MTX组比较，乙酸乙酯低剂量组bax表达相当（P＞0.05），乙酸乙酯中、高剂量组及氯仿各组均明显升高（均P＜0.01）。　　(5)氯仿及乙酸乙酯提取物对bcl-2/bax表达的影响　　与未加TNF-α组比较，TNF-α组bcl-2/bax升高（P＜0.05）。与TNF-α组比较，各组bcl-2/bax均明显降低（均P＜0.01）。与MTX组比较，乙酸乙酯低剂量组bcl-2/bax偏高（P＜0.05），乙酸乙酯中剂量组及氯仿低中剂量组变化不明显（均P＞0.05），乙酸乙酯及氯仿高剂量组bcl-2/bax水平明显降低（均P＜0.01）。　　(6)氯仿及乙酸乙酯提取物对caspase-3表达的影响　　qPCR显示，与未加TNF-α组比较，TNF-α组caspase-3水平降低（P＜0.05）。与TNF-α组比较，MTX组caspase-3升高（P＜0.05）。乙酸乙酯及氯仿低剂量组无变化(均P＞0.05)，乙酸乙酯（均P＜0.01）及氯仿（P＜0.05、P＜0.01）中、高剂量组升高。与MTX组比较，乙酸乙酯中、高剂量组及氯仿低、中剂量组无差异（均P＞0.05），乙酸乙酯低剂量组caspase-3偏低（P＜0.05）而氯仿高剂量组偏高（P＜0.05）。　　5.昆母提取物对ERK、pERK、JNK、pJNK、P38及p-P38的影响　　昆母乙酸乙酯及氯仿提取物干预24h。与未加TNF-α组比较，TNF-α组p-ERK与ERK比值稍升高(P＞0.05)。与TNF-α组比较，昆母乙酸乙酯低剂量组p-ERK与ERK比值变化不明显(P＞0.05)，中、高剂量组p-ERK与ERK比值明显下降，差异均有统计学意义（均P＜0.01）;昆母氯仿低、高剂量组p-ERK与ERK比值变化不明显(均P＞0.05)，中剂量组p-ERK与ERK比值明显降低(P＜0.01)。　　与未加TNF-α组比较，TNF-α组pJNK与JNK比率升高（P＜0.01）。与TNF-α组比较，昆母乙酸乙酯低剂量组及氯仿低、中剂量组比率下降（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.05），昆母乙酸乙酯中、高剂量组及昆母氯仿高剂量组均偏高，差异有统计学意义(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.05)　　与未加TNF-α组比较，TNF-α组p-P38与P38比率升高(P＜0.05)。与TNF-α组比较，昆母乙酸乙酯及氯仿提取物各组p-P38与P38比率均明显降低（均P＜0.01）。　　结论:　　1.昆母氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物及正丁醇提取物均能抑制RA-HFLS增殖，且抑制呈时间和浓度依赖性，时间越长，抑制率越高;浓度越大，抑制率越高。同浓度条件下，昆母氯仿、乙酸乙酯与石油醚提取物对RA-HFLS增殖的抑制作用比昆明正丁醇更强。　　2.昆母氯仿提取物及乙酸乙酯提取物对RA-HFLS增殖的抑制可能是通过降低Cyclin D1表达，使细胞周期G1期及S期发生阻滞实现的。　　3.昆母氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物及正丁醇提取物可以呈浓度依赖性地使RA-HFLS发生凋亡，浓度越高，凋亡率越高。　　4.昆母氯仿提取物及乙酸乙酯提取物促凋亡是由多种因素共同调节的，其机制可能是降低bcl-2表达，升高bax及caspase-3表达，降低bcl-2/bax比值。　　5.TNF-α诱导ERK、P38及JNK磷酸化的时间可能不同。昆母氯仿提取物及乙酸乙酯提取物可以抑制MAPK信号通路ERK、JNK、P38蛋白磷酸化。低、中、高剂量的昆母乙酸乙酯及氯仿提取物对MAPK信号转导通路的作用不同。