肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是指浸润在肿瘤组织中的巨噬细胞,是肿瘤微环境中非常重要的细胞成分。研究发现,放射和乏氧情况下肿瘤细胞对巨噬细胞的募集增多,即局部浸润的TAM增多,且这些TAM多呈现出促肿瘤的表型,促进肿瘤细胞生存,血管生成,抑制肿瘤局部的免疫反应,这在一定程度上增加了肿瘤对放疗的抵抗。因此研究放射和乏氧情况下巨噬细胞浸润增多的原因,采用相应的治疗方法抑制巨噬细胞浸润,则可以增加肿瘤对放疗的敏感性,改善治疗效果。β-榄香烯(β-elemene)是从中药温郁金提取的化合物,具有放疗增敏作用,目前研究发现其主要通过促进细胞凋亡、增强DNA损伤和抑制DNA修复等方面增强肿瘤细胞的放疗敏感性。但其是否对肿瘤中巨噬细胞浸润的过程有影响,还未见研究报道。放射可以激发活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生,调节过氧化物酶-1(Peroxiredoxin-1,Prx-1)等过氧化物酶的表达及核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)等信号通路的活性,促进细胞存活。肿瘤乏氧是实体瘤中常见的现象,而放射会破坏肿瘤的血管结构,进一步加重肿瘤的乏氧。乏氧时低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达增高,调控下游多个基因的转录,使细胞适应乏氧微环境。Prx-1、NF-κB、HIF-1α等信号通路和因子是否在巨噬细胞浸润过程中发挥作用,尚不明确,有待进一步研究。因此,本研究观察了放射和乏氧情况下,肺癌细胞对巨噬细胞浸润的影响及β-榄香烯对此过程的作用,并对肺癌细胞募集巨噬细胞的机制进行了探讨。旨在揭示放射和乏氧时巨噬细胞浸润增多的原因,以便采取针对性的治疗措施来抑制此过程,增加肿瘤的放疗敏感性;同时也进一步明确了β-榄香烯的放疗增敏机制,为其在临床上的合理应用提供依据。目的:1.研究放射和乏氧情况下,β-榄香烯对肺癌细胞募集巨噬细胞的影响。2.研究放射和乏氧情况下,肺癌细胞Prx-1、NF-κB和HIF-1α的表达及在肺癌细胞募集巨噬细胞过程中的作用,并进一步探讨这些因子之间的调控关系。3.研究放射及β-榄香烯对小鼠肺癌移植瘤生长及巨噬细胞浸润的影响,进一步验证体外实验结论。方法:第一部分:β-榄香烯对肺癌细胞募集巨噬细胞的影响1.MTT法检测不同浓度β-榄香烯对小鼠Lewis肺癌细胞的生长抑制作用,计算24h的IC50,IC20和IC10。2.将Lewis细胞分为:(1)对照组:只接受DMEM培养基处理;(2)放射组:X线单次剂量4Gy照射;(3)药物组:β-榄香烯45μg/ml作用24h;(4)药物联合放射组:45μg/mlβ-榄香烯作用24h后予4Gy单次剂量照射;(5)乏氧组:乏氧培养24h;(6)放射联合乏氧组:X线单次剂量4Gy照射后,乏氧培养24h;(7)药物联合乏氧组:45μg/mlβ-榄香烯作用24h后,乏氧培养24h;(8)药物、放射联合乏氧组:45μg/mlβ-榄香烯作用24h后,X线单次剂量4Gy照射后,乏氧培养24h。收集各组细胞上清,即条件培养基(conditioned medium,CM),使用Transwell实验检测各组Lewis细胞对小鼠巨噬细胞RAW264.7的募集作用。3.实时定量PCR、ELISA实验检测Lewis细胞及上清中相关趋化因子m RNA和蛋白的表达。4.将趋化因子中和抗体加入对照组、放射组、乏氧组、放射联合乏氧组上清后,Transwell实验检测Lewis细胞对RAW264.7细胞募集的变化情况。5.使用各组上清培养RAW264.7细胞,Western Blot、实时定量PCR实验检测巨噬细胞分型标志物的表达。第二部分:肺癌细胞Prx-1、NF-κB和HIF-1α的表达、相互调控及对巨噬细胞募集的影响1.Western Blot、实时定量PCR、免疫荧光实验检测放射和乏氧条件下,Lewis细胞中Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1α蛋白及m RNA的表达。2.Lewis细胞分别转染Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1αsi RNA,在放射和乏氧条件下,收集上清,ELISA实验检测趋化因子的变化情况。3.提取细胞蛋白,Western Blot实验检测抑制一个基因表达后,其他两个基因蛋白表达的变化情况。4.Lewis细胞分为:(1)对照组(2)放射组(3)药物组(4)药物联合放射组(5)乏氧组(6)放射联合乏氧组(7)药物联合乏氧组(8)药物、放射联合乏氧组。提取细胞蛋白,Western Blot检测各组Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1α蛋白表达。第三部分:放射及β-榄香烯对小鼠肺癌移植瘤生长及巨噬细胞浸润的影响1.采用细胞悬液皮下接种法建立小鼠(C57BL/6)肺癌移植瘤模型并随机分组(每组6只):对照组(Na Cl)、45mg/kgβ-榄香烯组、放射组(Na Cl+放射)、45mg/kgβ-榄香烯联合放射组。2.隔日测量移植瘤的体积,绘制肿瘤生长曲线。3.末次处理后,观察14d,切取肿瘤,拍照,称瘤重,计算抑瘤率。4.移植瘤组织制作石蜡切片,免疫组化方法检测巨噬细胞浸润及趋化因子表达。结果:第一部分:1.β-榄香烯作用Lewis细胞24h的IC10、IC20、IC50分别为28.11μg/ml、43.75μg/ml和93.17μg/ml。2.与对照组相比,放射组、乏氧组和放射乏氧组的上清对RAW264.7细胞的趋化作用增强(P<0.05),加入β-榄香烯后,各组这种增强的趋化作用被抑制(P<0.05)。3.Lewis细胞中趋化因子MCP-1的m RNA表达在放射组、乏氧组和放射联合乏氧组增高(P<0.05),且可以被β-榄香烯抑制(P<0.05)。ELISA实验观察到放射组、乏氧组和放射联合乏氧组Lewis细胞MCP-1分泌增多(P<0.05),加入β-榄香烯后,MCP-1分泌增多被抑制(P<0.05)。4.将MCP-1中和抗体加入放射组、乏氧组和放射联合乏氧组的上清进行孵育后,与对应未加中和抗体组相比,上清对RAW264.7细胞的趋化作用减弱(P<0.05)。5.使用各组上清培养RAW264.7细胞后,放射组、放射联合乏氧组的上清培养后的RAW264.7细胞,促肿瘤的M2表型标志因子ARG1蛋白表达及IL-10,MRC1m RNA表达增加(P<0.05)。第二部分:1.放射和乏氧条件下,Lewis细胞Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1α的表达:1)放射组、放射联合乏氧组Prx-1蛋白及m RNA表达增高(P<0.05),乏氧组Prx-1蛋白及m RNA表达无变化(P>0.05);2)放射组、乏氧组、放射联合乏氧组NF-κB/p65入核增多,HIF-1α蛋白及m RNA表达增高(P<0.05)。提示放射调控了Prx-1表达、NF-κB/p65入核和HIF-1α表达;而乏氧不调控Prx-1表达,只调控NF-κB/p65入核和HIF-1α表达。2.Lewis细胞转染Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1αsi RNA后,各组上清MCP-1表达的变化:1)转染Prx-1 si RNA后,放射组、放射乏氧组MCP-1分泌不再增多,与各自未转染组相比,差异有统计学意义(P<0.05),但乏氧组MCP-1分泌不受影响,仍增高(P>0.05),提示抑制Prx-1表达影响放射诱导的MCP-1分泌,但不影响乏氧诱导的MCP-1分泌;2)转染NF-κB/p65 si RNA后,放射组、乏氧组和放射乏氧组MCP-1分泌均不再增多,与各自未转染组相比,差异有统计学意义(P<0.05),说明抑制NF-κB/p65表达影响放射和乏氧诱导的MCP-1分泌;3)转染HIF-1α的si RNA后,放射组、乏氧组和放射乏氧组MCP-1分泌也不再增多,与各自未转染组相比,差异有统计学意义(P<0.05),说明抑制HIF-1α表达影响放射和乏氧诱导的MCP-1分泌。3.Lewis细胞分别转染Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1αsi RNA后,其他两个基因蛋白表达的变化:1)转染Prx-1 si RNA后,放射组、放射联合乏氧组的HIF-1α表达增高及NF-κB/p65入核增多被抑制(P<0.05),提示放射后Prx-1调控了NF-κB/p65入核及HIF-1α表达;2)转染NF-κB/p65 si RNA后,放射组、乏氧组、放射联合乏氧组HIF-1α表达增高被抑制(P<0.05);放射组、放射联合乏氧组Prx-1表达不受影响(P>0.05),仍增高。提示放射和乏氧后NF-κB/p65调控了HIF-1α的表达,但不调控Prx-1表达;3)转染HIF-1αsi RNA后,放射组、乏氧组、放射联合乏氧组NF-κB/p65入核不受影响(P>0.05),仍增加;放射组、放射联合乏氧组Prx-1表达也不受影响(P>0.05),仍增高。提示放射和乏氧后HIF-1α不调控NF-κB/p65入核和Prx-1表达。4.已有实验结果提示放射后Lewis细胞内存在Prx-1/NF-κB/HIF-1α上下游调控关系,TLR4是介导NF-κB通路激活的重要因子,因此将Lewis细胞转染TLR4si RNA,抑制TLR4表达,放射诱导的NF-κB/p65入核增多被抑制(P<0.05)。提示放射后Prx-1通过TLR4激活NF-κB。5.β-榄香烯抑制放射组、放射联合乏氧组Prx-1表达增加、NF-κB/p65入核增加(P<0.05);抑制放射组,乏氧组,放射联合乏氧组HIF-1α表达增加(P<0.05);但对乏氧组的NF-κB/p65入核增加没有影响(P>0.05)。第三部分:1.成功建立小鼠肺癌移植瘤模型,根据移植瘤体积获得各组的生长曲线,治疗第7天,各治疗组移植瘤体积均小于对照组(P<0.05);至第15天,β-榄香烯联合放射组移植瘤体积明显小于其他各组(P<0.05);增敏系数(enhanced factor,EF)为1.65,提示该剂量β-榄香烯具有放疗增敏作用。2.放射组、β-榄香烯组移植瘤重量小于对照组(P<0.05),β-榄香烯联合放射组移植瘤重量小于放射组和β-榄香烯组(P<0.05),放射组、β-榄香烯组、β-榄香烯联合放射组抑瘤率分别为:46.01%,36.81%和72.39%。3.与对照组相比,放射组巨噬细胞浸润增多(P<0.05),β-榄香烯组联合放射巨噬细胞的浸润少于放射组(P<0.05)。4.与对照组相比,放射组MCP-1表达增多(P<0.05),β-榄香烯联合放射组MCP-1表达少于放射组(P<0.05)。结论:第一部分:1.放射和乏氧促进肺癌细胞对巨噬细胞的募集,并且放射还可以促进巨噬细胞向促肿瘤M2表型转化。2.放射和乏氧促进肺癌细胞分泌MCP-1。3.放射和乏氧促进的肺癌细胞对巨噬细胞的募集依赖于MCP-1。4.β-榄香烯抑制放射和乏氧促进的肺癌细胞对巨噬细胞的募集。5.β-榄香烯抑制放射和乏氧促进的肺癌细胞分泌MCP-1。第二部分:1.放射可以诱导肺癌细胞Prx-1表达、激活NF-κB、促进HIF-1α表达;乏氧对肺癌细胞Prx-1的表达无影响,但可以激活NF-κB和促进HIF-1α表达。2.放射诱导的MCP-1表达依赖于Prx-1、NF-κB、HIF-1α;但乏氧诱导的MCP-1表达不依赖于Prx-1,只依赖于NF-κB、HIF-1α。3.放射后肺癌细胞存在Prx-1/NF-κB/HIF-1α调节通路;乏氧后肺癌细胞存在NF-κB/HIF-1α调节通路。4.放射后Prx-1激活NF-κB依赖于TLR4。5.β-榄香烯抑制放射后肺癌细胞Prx-1表达、NF-κB激活及HIF-1α表达;β-榄香烯抑制乏氧后HIF-1α表达。第三部分:1.放射及β-榄香烯都可以抑制小鼠肺癌移植瘤的生长,联合应用后抑制肿瘤效果更加明显,β-榄香烯具有放射增敏作用。2.放射后小鼠肺癌移植瘤内巨噬细胞浸润增多,β-榄香烯抑制其浸润增多。3.放射后小鼠肺癌移植瘤内MCP-1表达增多,β-榄香烯抑制其表达增多。