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伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus, PRV)是疱疹病毒科(Herpesviridae)a疱疹病毒亚科的成员,可引起猪、牛、羊及野生动物的伪狂犬病,猪是其主要宿主,伪狂犬病给养猪业造成了巨大的经济损失。为了加强对该病的疫情监测和流行病学调查,有必要研究开发出一种特异性强、敏感性高的血清学检测试剂。PRV的结构蛋白gB和gD非常保守且具有良好的免疫原性,可作为理想的血清学检测用抗原。本研究利用大肠杆菌表达系统表达了伪狂犬病毒gB和gD蛋白主要抗原表位区,获得了纯化的重组蛋白,用纯化的gB重组蛋白建立了gB-ELISA诊断方法,用于检测猪血清中PRV gB抗体。主要研究内容如下:一、猪伪狂犬病毒结构蛋白gB和gD主要抗原区的原核表达参照GenGank发表的PRV中国株基因序列,分别针对gB和gD基因设计引物,通过PCR方法扩增出包含gB和gD主要抗原表位区600bp和677bp的基因片段,克隆到pGEM-T-Vector上,再分别插入到原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游,建立pET-gB和pET-gD两个重组表达载体,将载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物分子量大小分别为42.4KDa和45.2KDa。经BandScan分析,表达量分别占菌体蛋白的60.5%和52.3%。Western-blot分析结果表明,表达的两个重组蛋白均能与PRV猪阳性血清发生特异性反应。表达产物经His·Bind亲和层析法纯化后,获得的重组蛋白gB和gD的浓度达到1mg/ml和0.98mg/ml。二、猪伪狂犬病毒血清抗体间接gB-ELISA检测方法的初步建立以在大肠杆菌中高效表达的伪狂犬病毒gB重组蛋白作为抗原,包被聚乙烯反应板,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG为二抗,初步建立了针对血清gB抗体的间接gB-ELISA。对ELISA各种反应条件进行优化,确定了最适工作条件。研究表明,重组抗原最适包被浓度为315ng/孔,4℃包被过夜,待检血清最适稀释度为1:40。待检血清和酶标记二抗的反应温度和时间均为37℃,30min;底物37℃显色10min,读取OD450值。血清样品OD450≥0.1×ODP+0.9×ODN判为阳性。运用本方法检测猪血清样品时,与阴性血清反应的本底值极低,与强阳性血清反应的OD450高达2.0以上。用建立的间接gB-ELISA分别检测猪圆环病毒病、细小病毒感染、猪瘟、猪日本脑炎和猪繁殖与呼吸综合征阳性血清,结果均为阴性,说明该方法具有高度特异。批间、批内重复性试验结果变异系数均小于8%。与IDEXX PRV gB ELISA试剂盒进行比对,本研究建立的间接gB-ELISA方法的敏感性和特异性分别为75%(27/36)和80.7%(67/83),符合率为79%(94/119)。