大肠杆菌内源性非编码RNA OxyS对秀丽线虫che-2基因表达与行为的调控

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目的:研究大肠杆菌内源性非编码RNAOxyS对取食大肠杆菌的秀丽线虫化学感受基因che-2的表达和秀丽线虫行为的调控,以及这种调控作用的分子机理。方法:通过秀丽线虫行为学实验分析大肠杆菌内源性非编码RNAOxyS对秀丽线虫行为的影响;逆转录PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)和实时定量PCR分别对秀丽线虫的化学感受基因che-2的mRNA表达进行半定量和定量的对比;通过蛋白质印迹(Western Blot)对秀丽线虫的CHE-2::GFP蛋白进行定量对比;使用共聚焦显微镜对秀丽线虫体内具有荧光标记的che-2基因时空表达进行成像研究。结果:1.食物竞争实验:OxyR和OxyS细菌上的野生型秀丽线虫N2的线虫数量随着时间逐渐减少,而ΔOxyS细菌上的线虫数量无明显变化。OxyS细菌上减少的线虫数量多于OxyR细菌。食物寻找能力实验:90min内95%的野生型N2能够找到食物OP50细菌,持续喂食OxyR或OxyS细菌一周后的野生型N2线虫能找到食物的线虫数量明显减少,分别为80%和75%,而且喂食OxyS细菌者比喂食OxyR细菌者更少。而只有大约10%的che-2突变型线虫能够找到食物OP50细菌。2.氯化钠趋化实验:90min内95%的野生型N2能够到达氯化钠液滴,持续喂食OxyR或OxyS细菌一周后的野生型N2能够找到氯化钠液滴的线虫数量明显减少,分别为40%和25%,而且喂食OxyS细菌者比喂食OxyR者更少。只有大约10%的che-2突变型线虫能够找到氯化钠。醋酸钠化学躲避实验:90min内5%的野生型N2穿过醋酸铜线到培养盘的另一端,持续喂食OxyR或OxyS细菌一周后的野生型N2穿过醋酸铜线的数量明显增加,分别为20%和35%,而且喂食OxyS细菌者比喂食OxyR者更多。大约45%的che-2突变型线虫穿过醋酸铜线。3.食物竞争实验:野生型N2在OxyS细菌上的线虫数量随着时间逐渐减少,但在OxyS-cb细菌上无明显变化。C. briggsae线虫在OxyS-cb细菌上的线虫数量随着时间逐渐减少,但在OxyS细菌上无明显变化。4.食物竞争实验:野生型N2在OxyR细菌上的线虫数量随着时间逐渐减少,alg-2,sid-1,sid-2突变型线虫在OxyR细菌上的线虫数量也减少,dcr-1,rde-1,rde-2突变型线虫减少的程度相对较小,而alg-1,rde-4突变型线虫减少的程度最小。5.食物竞争实验:野生型N2在OxyS细菌上的线虫数量会随着时间明显减少,而在che-2RNAi1细菌,che-2RNAi2细菌上的线虫数量减少的程度相对较小。食物寻找能力实验:90min内95%的野生型N2能够找到食物OP50细菌,喂食OxyS细菌、che-2RNAi1细菌或che-2RNAi2细菌一周后的野生型N2找到食物的线虫数量明显减少,分别为60%,75%,70%,而且喂食OxyS细菌者比喂食che-2RNAi细菌者更少。6.共聚焦显微成像实验:持续喂食OxyR或OxyS细菌一周后的转基因线虫Pche-2::che-2::gfp的CHE-2::GFP荧光蛋白强度减弱。给予转基因线虫Pche-2::che-2::gfp注射体外转录合成的OxyS RNA后CHE-2::GFP荧光蛋白强度减弱。给予转基因线虫Pche-2::che-2::gfp注射17nt的单链小RNA后CHE-2::GFP荧光蛋白强度也减弱,但与注射OxyS RNA相比程度较小。蛋白质印迹表明以OxyR和OxyS细菌持续喂食转基因线虫Pche-2::che-2::gfp一周后其CHE-2::GFP蛋白含量水平降低。半定量逆转录PCR和实时定量PCR结果表明分别以OxyR和OxyS大肠杆菌持续喂食野生型N2一周后其che-2mRNA表达水平下降。结论:1.表达OxyS的大肠杆菌通过抑制秀丽线虫化学感受能力驱逐线虫,从而使其免于秀丽线虫的捕食产生自身保护作用。2.大肠杆菌内源性非编码RNA OxyS在mRNA水平下调秀丽线虫化学感受基因che-2的表达。3.非编码RNA OxyS可能可以产生物种间的进化作用,如捕食者(秀丽线虫)与被捕食者(大肠杆菌)间可能存在共同进化的关系,这将可能加深对生命科学研究的一个基本命题,即环境(包括食物)与动物基因表达的相互关系的认识。
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