背景与目的：　　葡萄糖调节蛋白78(GRP78)是内质网中的分子伴侣,是热休克蛋白70家族的成员之一,GRP78参与未折叠蛋白反应(UPR),在维持细胞内环境的稳态方面发挥了十分重要的作用。近年来有研究报道,GRP78可以影响树突状细胞(DC)的发育,DC是目前发现的功能最强的专职抗原递呈细胞(APC),在免疫应答及启动抗肿瘤免疫反应中均起着关键作用。课题组前期工作证明,增加糖调节蛋白78(Grp78)在胰岛β细胞的表达不仅可以保护胰岛β细胞抵抗凋亡,同时还可诱导免疫负调 T细胞的形成,参与免疫调节,但其机制尚不清楚。本实验构建了鼠源性GRP78原核表达载体,并进行了表达与纯化,进一步将纯化蛋白加入小鼠骨髓来源的DC诱导培养体系中,应用流式细胞术检测GRP78对DC分化的影响,为进一步研究GRP78在细胞凋亡以及免疫调节中的作用奠定了基础。　　方法：　　1.PGEX-4T-3-GRP78表达载体的构建　　以鼠源GRP78的载体pIRES2-EGFP-GRP78为模板,设计与GRP78互补的引物,引入酶切位点,采用PCR扩增GRP78基因,将PCR产物与pGEM-T载体连接,对含有目的基因的pGEM-T-GRP78质粒进行测序鉴定,将测序正确的质粒进行扩增,酶切 GRP78目的基因片段,亚克隆至 pGEX-4T-3,连接产物转化大肠杆菌DH5α,过夜培养后提取质粒酶切电泳鉴定。　　2.GRP78蛋白的表达与纯化　　将成功构建的表达质粒转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物通过12％SDS-PAGE鉴定,根据鉴定结果选择最适IPTG诱导浓度及诱导时间,诱导表达产物采用Western-blot鉴定。提取可溶性蛋白,采用GST纯化试剂盒纯化蛋白,收集纯化产物进一步经12％SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定。　　3.小鼠骨髓来源DC的制备及培养与表面标志的检测　　从Balb/c小鼠中分离骨髓来源的单个核细胞,加入约16ml完全培养基(1640+10％胎牛血清),轻轻吹打混匀,转入24孔板中,2ml/孔,并分别加“双抗”(青霉素/链霉素),终浓度为100U/ml,GM-CSF终浓度10ng/ml,37℃,5％CO2温箱;设立不同实验组,包括:①对照组;②LPS刺激组;③未处理组;④加入纯化的rmGRP78蛋白;⑤-⑧不同时间加入纯化的rmGRP78蛋白+LPS组。于第3日、第5日半量换液,第7日弃上清加约1ml培养基。12h后采用流式细胞术检测细胞表面分子的表达。　　结果：　　1.测序正确的pGEM-T-GRP78质粒酶切GRP78目的基因片段,与相应酶切的表达载体pGEX-4T-3连接,连接产物转化大肠杆菌,过夜培养后提取质粒酶切电泳鉴定。酶切鉴定符合鼠源GRP78理论值,DNA序列分析结果显示与Gene Bank中的GRP78序列一致,蛋白序列完全相符,结果表明鼠源GRP78克隆以及原核表达载体pGEX-4T-3-GRP78构建成功。　　2.表达质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物采用BCA法测定其蛋白浓度约为2mg/mL,SDS-PAGE电泳鉴定在78KD处可见明显蛋白条带,与GRP78的理论值相符,表达产物经纯化后的纯度可达到90％以上。Western blot鉴定结果显示,纯化蛋白可与抗GRP78抗体特异性结合,结果提示成功获得纯化的表达产物。　　3.将rmGRP78与骨髓来源的单个核细胞进行共培养后,CD11c+细胞比例明显少于对照组。　　结论：　　成功构建了PGEX-4T-3-GRP78质粒,并表达纯化GRP78蛋白,细胞效应实验证明GRP78蛋白可以抑制单个核细胞向DC细胞的分化。为进一步研究GRP78的免疫调节作用奠定了良好的基础。