M2型丙酮酸激酶在早孕小鼠子宫内膜的表达

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目的:成功的胚胎植入是正常妊娠的先决条件。胚泡植入子宫内膜的过程涉及多种激素、细胞因子、粘附分子、免疫系统等的协同作用,与代谢途径也密切相关。糖代谢是三大物质代谢中重要组成部分,组织细胞在有氧条件下进行糖酵解的现象称为瓦氏效应(Warburg effect)。M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,Pkm2)是糖酵解过程中一个标志性的代谢酶,在糖酵解过程中发挥重要作用。已有研究表明在早孕小鼠子宫内膜蜕膜化过程中存在有氧糖酵解这一特殊现象,课题组前期基因芯片筛查结果初步显示Pkm2在早孕D5小鼠子宫内膜的表达呈现着床点高于着床旁的趋势。但是,Pkm2在早孕小鼠子宫内膜的表达规律、与子宫内膜蜕膜化的关系并不清楚。因此,本研究初步探讨Pkm2在早孕小鼠子宫内膜的表达规律,为后续进一步探讨其在早孕小鼠子宫内膜中的作用提供依据。  方法:  (1)建立正常妊娠小鼠模型,分别收集孕D1、D4、D5、D6、D7小鼠子宫内膜组织,采用Real-time PCR、免疫印迹法和免疫组织化学方法,检测Pkm2在早孕小鼠子宫内膜中的表达规律。  (2)建立假孕小鼠模型,分别收集假孕PD1、PD4、PD5、PD6、PD7天小鼠子宫内膜组织,采用Real-time PCR、免疫印迹法和免疫组织化学方法,检测Pkm2在假孕小鼠子宫内膜中的表达规律。  (3)建立体内人工诱导蜕膜化模型,分别收集诱导侧和未诱导侧小鼠子宫,采用Real-time PCR、免疫印迹法和免疫组织化学方法,检测Pkm2在诱导侧和未诱导侧子宫内膜的表达。  (4)建立体外人工诱导蜕膜化模型,分离原代小鼠子宫内膜基质细胞,采用雌、孕激素对分离的原代小鼠子宫内膜基质细胞诱导蜕膜化。采用免疫荧光检测细胞Vimentin蛋白表达的方法鉴定分离的子宫内膜基质细胞纯度,采用Real-time PCR、免疫印迹法方法检测Pkm2在子宫内膜基质细胞诱导蜕膜化后及未诱导蜕膜化子宫内膜基质细胞的表达。  结果:  (1)在早孕小鼠子宫内膜组织中,Pkm2 mRNA及蛋白的表达在孕D6达到高峰,孕D6和孕D7的表达明显高于孕D1;孕D5、D6、D7天着床点子宫内膜Pkm2 mRNA和蛋白的表达均显著高于着床旁子宫内膜;在孕D1、D4 Pkm2蛋白主要表达于子宫内膜的腔上皮和腺上皮,部分基质细胞也有表达;孕D5、D6、D7着床旁子宫内膜,Pkm2蛋白在子宫内膜基质细胞、腺上皮和腔上皮均有表达,且随着妊娠天数的增加表达有逐渐增强的趋势;孕D5、D6、D7着床点子宫内膜,Pkm2蛋白主要表达于胚胎和蜕膜区,腔上皮未见明显表达。  (2)在假孕小鼠子宫内膜组织中,Pkm2 mRNA从假孕PD6开始有明显增强,PD6与PD7的表达相当,且表达量明显高于PD1;Pkm2蛋白的表达每组间无显著差异;PD1 Pkm2蛋白主要表达于子宫内膜腔上皮和腺上皮,基质细胞表达较少,PD5、PD6、PD7 Pkm2蛋白主要在子宫内膜的腺上皮表达,腔上皮及基质细胞表达减少。  (3)在体内人工诱导蜕膜化模型中,Pkm2 mRNA及蛋白的表达在诱导侧子宫内膜的表达明显高于未诱导侧;Pkm2蛋白在诱导侧子宫内膜广泛表达,在未诱导侧子宫内膜主要表达于腔上皮和腺上皮,少量表达于基质细胞。  (4)分离培养小鼠子宫内膜基质细胞,并用E2+P4诱导其发生蜕膜化,Pkm2 mRNA及蛋白在子宫内膜基质细胞诱导蜕膜化后的表达明显高于未诱导蜕膜化的子宫内膜基质细胞的表达。  结论:  (1)Pkm2在早孕小鼠子宫内膜呈规律表达。  (2)Pkm2可能参与早孕小鼠子宫内膜蜕膜化。
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