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从本实验室所构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条阅读框为606 bp,编码201个氨基酸残基,预测分子量为22.3 KD,等电点为9.70的cDNA序列。生物信息学分析发现其编码的蛋白与果蝇Enhancer of Split(E(spl))编码的bHLH(helix-loop-helix)蛋白有较高的同源性,都含有一个bHLH保守结构域,一个Orange结构域和羧基末端的(W-R-P-W)结构域。该基因命名为BmE(spl)-like(Bomvyx mori Enhancer of Split like)。GenBank登录号为:GU238288。
将BmE(spl)-like基因ORF克隆到融合表达载体pET-28a相应的酶切位点上,得到重组表达质粒pET-28a-BmE(spl)-like,经PCR、酶切鉴定以及测序证明重组子正确。将该重组子转化大肠杆菌BL21(DE3),用终浓度为1 mmol/L IPTG诱导工程菌后裂解菌体作SDS-PAGE分析,结果与阴性对照相比出现特异的融合蛋白表达条带。融合蛋白以不溶性的包涵体的形式存在,对包涵体进行溶解,采用亲和层析和FPLC反向柱纯化融合蛋白His-BmE(spl)-like。质谱鉴定该融合蛋白的分子量为26.28 KD,与理论值25.86 KD(融合标签3.56 KD,22.30 KD)相符。将纯化所得的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,并用Protein A凝胶柱纯化多克隆抗体。ELISA检测该抗体的效价可达1:25600以上,且具有很高的特异性。另外,我们提取了家蚕不同发育时期和五龄幼虫不同组织的总RNA和总蛋白,通过实时荧光定量PCR和Western blotting的方法,发现BmE(spl)-like在不同组织和不同发育阶段的转录和表达水平存在较大的差异。实时荧光定量PCR结果表明BraE(spl)-like在家蚕四个发育时期中的转录由高到低依次为蛾、卵、三龄幼虫、蛹。在五龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为表皮、头、肠、气管、睾丸、卵巢、丝腺、脂肪体和马氏管。Westernblotting结果表明,该蛋白在家蚕的四个发育时期和五龄幼虫的性腺、丝腺、表皮、脂肪体、肠和头部中均有表达,而在马氏管和气管中该蛋白含量最低。我们还对该蛋白进行了亚细胞定位,主要分布在BmN细胞的细胞质中。通过His Pull-down技术分析了蛹中与BmE(spl)-like结合的蛋白,电泳分析发现蚕蛹中可与BmE(spl)-like结合的蛋白至少有2个,大小主要位于45 KD左右。