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乙型肝炎是一种严重危险人类健康的全球性疾病,疫苗是预防和治疗乙肝的重要手段。本研究构建了表达HBV（中国流行株）表面抗原的DNA疫苗,并在表达载体中引入了人特异的CpG免疫刺激序列,摸索了一套适合于人用DNA疫苗中试生产的工艺路线。经过两步纯化,有效地去除菌液中的蛋白质和杂质核酸,降低了内毒素含量,使得到的DNA疫苗的质量符合有关标准。从体液免疫、细胞免疫全面地考察了乙肝DNA疫苗的免疫原性,发现DNA疫苗能在免疫小鼠体内表达目的抗原,能诱导出抗原特异性的体液反应和细胞免疫,诱导的抗体的IgG亚型疫IgG2（?）为主。进一步考察了乙肝DNA疫苗对HBV转基因小鼠的治疗作用。DNA疫苗免疫后,转基因小鼠血清中HBsAg水平均有不同程度地下降,部分小鼠HBsAg完全转阴;DNA疫苗能诱导出特异性的抗体反应,说明DNA疫苗能打破转基因小鼠对乙肝病毒的免疫耐受。 鉴于DNA疫苗的免疫原性较低,本课题分别通过改善疫苗的免疫方案、改善疫苗的剂型,来提高乙肝DNA疫苗的免疫效果。采用DNA疫苗、蛋白质疫苗联合免疫的策略,从不同免疫组合、不同免疫次序、不同免疫次数的8种免疫方案中筛选得到的一种最佳联合方案（2次DNA疫苗初免和1次蛋白质疫苗加强免疫的组合）,能明显地增强体液免疫和细胞免疫。本课题采用PLGA微球制剂的两种剂型分别包裹或吸附乙肝DNA疫苗,系统地考察了疫苗新剂型的免疫效果,并探讨了其增效的分子机制。结果表明两种微球给药系统明显地增强DNA疫苗的免疫原性,PLGA包裹的乙肝DNA口服疫苗缓慢释放质粒DNA,不仅诱导了系统的抗原特异性免疫,还能诱导高效的消化道粘膜免疫反应。增强的免疫原性与微球制剂的缓释、靶向给药的特点有关。研究发现乙肝DNA疫苗PLGA微球制剂延长目的基因的转录和表达,还能靶向性向抗原提呈细胞递送DNA疫苗。 HBx是一种多功能蛋白,为病毒基因组转录所必需。HBx与许多共刺激因子、转录因子相互作用,调控靶基因的转录,从而影响HBV感染的细胞的功能。由于HBx在乙肝以及乙肝引起的肝硬化、肝癌的肝组织上较HBV其他亚基有更高的表达率,所以本研究将其作为靶抗原,联合应用超基序法、延展基序法、量化基序法等生物信息学的表位预测方案,并结合生物学功能实验加以验证,筛选到3个来源于HBx、并能与HLA-A*0201分子高亲和性结合的抗原九肽VLHKRTLGL（92-100）,