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疫苗是预防感染性疾病最有效的武器。而自然界中,多种病毒如流感病毒（influenzavirus）、人免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus,HIV）、鼻病毒（Rhinovirus）、人乳头瘤病毒（Humanpapillomavirus,HPV）等在进化中产生的众多基因型以及表面抗原区的基因序列变异,成为这些疫苗研发的一大障碍。如何突破病毒型别特异性,进行广谱疫苗的设计,具有重要的研究意义。HPV是一种无包膜的双链DNA病毒,目前已鉴定出200种型别以上,分为低危型和高危型两类。其中,低危的6和11型主要引起尖锐湿疣等疣状病变,而高危型HPV持续性感染可导致包括宫颈癌在内的多种癌症。世界卫生组织（WHO）2018年统计数据显示,每年全球宫颈癌新发病例高达57万,死亡31.1万。在我国,每年大约有新发病例10.6万,死亡病例4.8万。病毒致癌性和分子流行病学研究显示,与宫颈癌等癌症相关的HPV至少有十八种型别。HPV结构蛋白L1可在体外一定条件下自组装,形成病毒样颗粒（Virus-like particle,VLP）,其具有良好的免疫原性。但野生型HPV VLP诱导的免疫保护是型别限制性的（type-restricted）,不能实现有效的跨型保护。使用混合多种型别VLPs的多价疫苗是扩大保护范围的主要手段。目前已上市的HPV疫苗有三种,分别是二价苗、四价苗和九价苗。其中,保护范围最广的是九价苗,可预防两种低危型和七种高危型HPV的感染,覆盖大约90%的宫颈癌,但仍有另外10%没有得到保护。随着疫苗的推广和时间推移,疫苗所能预防的病毒型别的感染会逐渐减少,但疫苗未覆盖的HPV型别的传播和进化很可能进一步扩大对人类健康的威胁。所以,有必要研发保护范围更广的下一代HPV疫苗。而传统的增加VLPs种类的方法由于疫苗剂量过高,面临着潜在的副反应高、工艺难度大及成本控制等问题。在九价苗基础上进一步增加VLPs种类至二十价苗具有很大的挑战性。HPV大多数中和抗体表位均位于L1表面环区（loop）上,且涉及多个表面环区。本课题组前期研究表明,将HPV的型特异性中和抗体表位关键氨基酸移植到另一亲缘关系较近的HPV型别对应位点上,产生的突变的VLPs可以获得与上述中和抗体的结合活性。受此启发,本研究尝试通过表位移植构建嵌合VLP的方式进行HPV型交叉疫苗的设计,以此打破HPV型特异性。首先,本研究分析了二十种型别HPV主要结构蛋白L1的进化关系,发现按照亲缘关系的远近可以分为7组,HPV33/58/52和HPV18/45/59分别归属于不同的亲缘关系组,组内型别亲缘关系较近,而两组间亲缘关系较远。为了进一步分析型别间结构差异与其进化距离的相关性,本研究利用X-射线晶体学技术成功解析了 HPV33和HPV52五聚体的晶体结构,分辨率分别为2.9 （?）和2.75 （?）。将两种型别五聚体晶体结构与已经报道的HPV58/18/59三种型别结构叠加一起比较,发现同一亲缘关系组甚至不同亲缘关系组的HPVL1在整体结构上高度保守,但其在表面loop区,尤其是远缘型别间的loop区,存在微小的构象差异。我们猜想,在亲缘关系较近的型别间进行表位移植形成的嵌合体更容易产生交叉中和保护。鉴于绝大多数中和抗体表位均位于表面loop区,因此我们选择在亲缘关系最近的HPV33/58之间进行loop的相互替换,构建了 10个L1嵌合抗原,分别为以 HPV33 为骨架的 H33-58BC、H33-58DE、H33-58EF、H33-58FG和 H33-58HI 以及以 HPV58 为骨架的 H58-33BC、H58-33DE、H58-33EF、H58-33FG和H58-33HI。这些嵌合L1抗原均可在体外自组装形成相应的嵌合VLPs,利用透射电镜（TEM）、高效液相排阻色谱（HPSEC）和分析超离（AUC）分析发现,这些嵌合VLPs在颗粒大小、形态上与骨架型别野生型VLP相似,且具有较好的均一性;利用差示扫描量热法（DSC）发现嵌合VLPs具有与骨架型别野生型VLP类似的结构稳定性。接着分别选取HPV33和HPV58型特异性中和抗体,通过间接酶联免疫吸附实验（ELISA）测定嵌合VLPs的抗原性,结果表明多数嵌合VLPs获得了交叉抗原性。为了进一步测定嵌合VLPs的免疫原性,将嵌合VLPs以5μg剂量免疫小鼠,并利用假病毒中和试验（PBNA）测定小鼠血清中和滴度,结果表明10种嵌合VLPs均能产生针对HPV33和HPV58的交叉中和抗体,其中H33-58HI和H58-33BC交叉中和保护效果最优。进一步将两种嵌合VLPs以0.1μg、1μg和10μg三种不同剂量免疫小鼠,测定中和滴度,并评估了两种嵌合VLPs的半数有效剂量（ED50）。结果表明,H33-58HI和H58-33BC嵌合VLPs产生的交叉保护与HPV33/58野生型VLP相当,是良好的两型交叉疫苗候选抗原。为了考察单个氨基酸替换的突变VLPs是否也可以产生型交叉保护,我们分别构建了 HPV33 HI loop上型特异性氨基酸单点替换的4个突变VLPs（H33-S350K、H33-D351E、H33-S352G、H33-E357D）和 HPV58BC 环单点替换的 4 个突变 VLPs（H58-S80N、H58-N82T、H58-N84A、H58-V87L）,将 8 个单点突变VLPs免疫小鼠发现,大多数单点替换嵌合VLPs相比野生型均能产生更高的交叉中和滴度,表明loop上的型特异性位点对交叉中和的产生均有贡献。另外,为了考察远缘型别间的环替换是否也能产生交叉中和,相应于H33-58HI和H58-33BC,我们构建了 H33-59HI和H58-59BC两个嵌合VLPs,并以100μg剂量混合弗氏佐剂免疫小鼠,发现未有交叉中和抗体产生。结果表明,远缘型别间loop替换形成的嵌合VLPs难以产生交叉保护。然后,为了探究这种分子设计策略是否可以扩展到三种型别,本研究以H33-58HI和H58-33BC作为骨架,引入亲缘关系较近的HPV52,对两型嵌合抗原的剩余的四个loop进行同源替换,共构建了 8个嵌合VLPs,分别为H33-58HI-52BC、H33-58HI-52DE、H33-58HI-52EF、H33-58HI-52FG、H58-33BC-52DE、H58-33BC-52EF、H58-33BC-52FG和H58-33BC-52HI。同样经TEM、HPSEC、AUC和DSC检测确认,8个嵌合VLPs与骨架型别野生型VLP在颗粒大小、形态和热稳定性上相似。将8个嵌合VLPs免疫小鼠进行免疫原性的评价,结果表明H58-33BC-52HI嵌合VLP的三型交叉保护效果最优。进一步地,我们将H58-33BC-52HI嵌合VLP免疫非人灵长类,结果其产生的三型交叉中和滴度与3倍剂量的HPV33/58/52混合野生型VLPs相当,表明H58-33BC-52HI是良好的三型交叉疫苗候选抗原。最后,我们利用X-射线晶体学技术解析了 H58-33BC和H58-33BC-52HI五聚体的晶体结构,分辨率分别为2.5A和3.5A。将两种嵌合抗原结构与HPV33/58/52野生型结构对比发现,在嵌合五聚体上,同源替换后的BCloop和HI loop几乎分别再现了 HPV33野生型BC loop和HPV52野生型HI loop的构象,这也是嵌合抗原产生交叉中和保护的结构基础。另外,我们选取HPV33型特异性中和抗体4E5,4E5是构象性抗体,与HPV58无结合活性,但经ELISA反应性检测和表面等离子体共振（SPR）亲和力测定确认,4E5可以和嵌合抗原H58-33BC和H58-33BC-52HI结合,且亲和力与HPV33野生型相当。我们使用冷冻电镜（cryoEM）技术分别重构了 H33:4E5、H58-33BC:4E5、H58-33BC-52HI:4E5三种VLP-抗体复合物的结构,分辨率分别为12.3 （?）,12.0 （?）和10.0 （?）。将三种复合物的cryoEM结构对比发现,4E5在H58-33BC和H58-33BC-52HI嵌合VLP与HPV33 VLP上的结合模式相同,且结合区域均为BCloop和EFloop,这个结果有力的证明BC loop在从HPV33移植到HPV58上后模拟了 HPV33相应的分子表面,且与周围的HPV58 loop一起诱导了针对HPV33的中和抗体。综上所述,本研究通过分析二十种型别HPV的进化关系,并与其中五种型别HPV L1晶体结构保守性进行比较,发现近缘型别甚至远缘型别HPV在整体结构上高度保守,但在表面loop区,尤其是远缘型别的表面loop区存在微小差异;利用基于结构的同源替换方法,在HPV58/33/52三型别嵌合VLP上突破了HPV的型别特异性,实现了各型别抗原性和免疫原性的平衡（compromise）,并利用非人灵长类动物实验验证,其诱导出的交叉免疫保护抗体滴度与3倍剂量的野生型混合VLPs相当;进一步解析的嵌合抗原的晶体结构和复合物cryoEM结构揭示了嵌合VLPs产生交叉保护的结构基础。这种分子设计策略有望适用于HPV其他亲缘关系组（HPV16/31/35、HPV56/66/53、HPV26/69/51、HPV39/68/70、HPV18/45/59和HPV6/11）嵌合VLPs的设计,从而为研制由七种嵌合VLPs预防二十种型别HPV感染的下一代HPV疫苗奠定了基础,也为其他多型别病毒的疫苗设计提供了新的思路。