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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种以严重出血和高热为特征的高度接触性传染病。猪瘟可导致猪群大规模发病和死亡,流行于世界许多国家,给全球养猪业造成了巨大经济损失,并且严重威胁猪相关产品贸易,是危害养猪业最主要的传染病之一,被世界动物卫生组织列为法定报告疫病。CSFV在分类上属于黄病毒科瘟病毒属,其基因组由一条单股正链RNA组成,长约12 kb,编码一个多聚蛋白前体,此多聚蛋白在宿主细胞和病毒自身蛋白酶的作用下,可裂解和加工为12种成熟蛋白,其中C、Erns、E1和E2为结构蛋白,其余8种均为非结构蛋白。E2蛋白位于成熟病毒粒子的囊膜上,不仅与病毒吸附和入侵宿主有密切关系,而且也是诱导猪体产生免疫保护的最主要抗原蛋白。因此,E2蛋白是设计和开发抗CSFV疫苗、诊断试剂的理想靶标。虽然已有多株E2蛋白的单克隆抗体被筛选出来,并且在诊断领域得到了应用,但是目前仍未见CSFV E2蛋白纳米抗体的报道,并且常规单克隆抗体的制造成本较高,为降低诊断治疗试剂的成本以及为CSFV研究提供新的工具,开发新的廉价抗CSFV抗体很有必要。纳米抗体(Nanobodies,Nbs)衍生于骆驼体内存在的重链抗体,是目前已知天然存在的最小抗体片段。由于纳米抗体相对较长的CDR3区以及FR2区特征性亲水性氨基酸的存在,使其在具备分子量小的优势的同时,又兼具高亲和力、高可溶性、容易制造和表达、且可识别常规抗体不能识别的表位等优点,是诊断和治疗性生物试剂设计的理想候选体。本研究以E2蛋白为诱饵,利用酵母双杂交技术对前期实验室构建的纳米抗体文库进行了筛选,并对筛选出的纳米抗体进行了表达和初步的活性鉴定。主要内容如下:(1)根据GenBank中公布的CSFV C株序列,设计引物扩增出缺失跨膜区E2基因,成功构建pGBKT7-E2诱饵质粒,并对质粒的自激活活性和毒性进行了检测。结果表明E2蛋白在酵母细胞内无毒性和自激活能力,可用于酵母双杂交的筛选。利用此诱饵对纳米抗体酵母双杂交文库进行筛选后,成功获得8株阳性克隆。(2)将筛选的阳性克隆序列克隆至原核表达载体pET28a-SUMO,构建了纳米抗体原核表达载体;对纳米抗体进行诱导表达,优化表达条件,结果显示纳米抗体在30℃、IPTG浓度为0.6 mmol/L下诱导8 h表达量最佳;同时也构建了E2蛋白的原核表达载体pMal-c2X-E2,转化Rosetta感受态细胞后,成功诱导表达和纯化了E2蛋白。(3)通过间接ELISA、Western Blot和Dot Blot对表达纯化的纳米抗体活性进行了初步的鉴定。ELISA结果表明筛选出的纳米抗体可与CSFV反应,且反应活性显著高于阴性对照(P<0.05)。Western Blot和Dot Blot结果显示表达纯化的8株纳米抗体可特异性地与E2蛋白反应。