香猪繁殖相关7个候选基因表达研究

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猪是重要的农业动物,产仔数是制约猪生产行业的重要经济性状之一,是母猪繁殖性能的重要指标,香猪是中国小型猪的代表,其突出的特点是群体产仔数变异范围大,但影响香猪产仔数性状的分子机制尚未明了。本文以贵州高、低产香猪卵巢组织为实验材料,通过RT-qPCR实验技术、亚硫酸氢盐修饰-PCR测序等方法,从mRNA水平、表观遗传学角度展开研究,目的在于从转录组层面解析香猪产仔数性状的分子调节机制。主要结果如下:1.借助Illumina HiseqTM 2000平台,对香猪高、低产组卵巢进行转录组测序,获得92个差异表达的基因。选择7个候选基因进行深入研究,包括DMBT1、SERPINE2、RARRES1、LRP8、CDK1、CDC25C和PKA,其中CDK1、CDC25C和PKA三个基因富集于卵母细胞减数分裂信号通路。2.利用荧光定量PCR技术对香猪卵巢中DMBT1、SERPINE2、RARRES1、LRP8、CDK1、CDC25C和PKA共7个基因的表达量进行验证。除CDC25C基因外,定量PCR检测结果与转录组测序分析的趋势基本一致,其中SERPINE2、RARRES1两个基因在香猪高产组卵巢的表达量较高(P<0.05),其余5个基因在高低产组卵巢间的差异不明显。3.从香猪高、低产组卵巢基因组中,分别克隆了SERPINE2、RARRES1、PKA、CDK1和CDC25C基因的5’侧翼区序列,目标序列分别长为736 bp、828 bp、791bp、929 bp、1034 bp,与参考基因相应片段的相似性为97%至100%。除PKA外,其余四个基因片段中都包含了核心启动子序列,且这四个基因的5’侧翼区存在多个SNP位点,其中,SERPINE2在转录起始点上游307 bp处的A/C多态性和RARRES1基因在转录起始点上游781 bp处的G/C多态性影响转录因子的结合,从而影响转录效率,可能是高产香猪卵巢中SERPINE2和RARRES1基因表达量较高的原因。4.对香猪RARRES1基因启动子附近序列进行甲基化预测,RARRES1基因第一外显子ATG下游富含CpG位点,针对该区域设计特异性引物,对香猪卵巢基因组中RARRES1基因第一外显子区18个CpG位点进行甲基化检测。结果表明,有4个CG位点未被甲基化,另外3个CG位点全部发生了甲基化;有4个CG位点的甲基化程度高低产组之间存在明显差异,CpG-4、9和CpG-16位点香猪高产组中的甲基化占比较高,CpG-6位点在香猪低产组中的甲基化比例较高,Spearman相关分析结果显示,CpG-9和CpG-16两个位点的甲基化比例,与基因RARRES1的表达量高度正相关(r=0.896,P<0.01),提示RARRES1基因这两个位点的甲基化可能也是香猪产仔数高产的原因之一。综上所述,基于香猪卵巢转录组测序,对7个候选基因启动子区单核苷酸多态性进行研究,其中2个基因SERPINE2和RARRES1对香猪产仔数高产有直接影响,而其它5个基因对香猪产仔数的影响不明显。
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