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研究背景腺苷酸活化蛋白激酶（5’-adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK）是高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,由α-催化亚基、β-和γ-调节亚基组成的三聚体。AMPK主要通过感受及调节体内AMP/ATP的水平来维持机体的能量代谢。其中γ亚基通过与AMP/ATP结合改变AMPK空间构象,从而达到放大激活或是抑制其功能的作用。阿尔兹海默症（Alzheimer Disease,AD）是最常见的进行性神经退行性病变,以胞内高度磷酸化的Tau聚集形成的神经原纤维缠结（Neurofibrillary Tangles,NFTs）和细胞外淀粉样斑块沉积（Amyloid-beta,Aβ）为典型病理特征。AMPK的异常加剧NFTs及Aβ的形成及聚集,加重AD病理。AD又被称为三型糖尿病,其脑内存在与糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）相似的病理变化,比如胰岛素抵抗,毒性糖代谢中产物（如:甲基乙二醛）、终产物（如:高级糖化终产物）的积累。高级糖化终产物（Advanced Glycation End-products,AGEs）是一种翻译后修饰产物,主要是蛋白的精氨酸、赖氨酸以及组氨酸残基发生糖化修饰。糖化修饰可通过改变氨基酸电荷等物理特性来扰乱蛋白的结构功能。而AMPK是一个RD（Arg-Asp）激酶,通过电荷之间的相互作用来稳定其活化状态。那么AD疾病中AMPK功能紊乱是否与其糖化扰乱空间构象调节有关,目前,AD的AMPK功能障碍与异常累积的AGEs之间相互作用尚未明确。本文旨在揭示AMPK糖化在AD病理中的作用,为AD治疗提供新的治疗靶点。研究目的1.研究AD疾病中蛋白总糖化水平和AMPKγ亚基的糖化水平。2.探究AMPK功能与AMPKγ亚基糖化之间的关系。3.探讨AMPK糖化对AD病理学改变及认知障碍的作用。研究方法1.蛋白免疫印迹检测7.5月龄3×Tg-AD及C57BL/6小鼠脑内pAMPK/AMPK水平,采用免疫点印记法和免疫沉淀法检测小鼠脑蛋白糖化水平以及AMPKγ2亚基的糖化水平。2.BSA（30 mg/m L）蛋白加D-Glucose（0.5 M）与4种浓度精氨酸（0,36,180,360m M）分别37℃恒温孵育3个月。小鼠脑蛋白（13.5 mg/m L）加甲基乙二醛（20m M）（Methylglyoxal,MG,糖代谢中产物）与精氨酸（0,1.56,6.25,12.5,25,100,200 m M）同样条件下孵育14天。抗AGEs抗体进行免疫点印记检测蛋白糖化水平。3.将N2a细胞分为三组:对照组（PBS处理）,MG组（1 m M,1 h）及MG+Arg组（Arg,6.4 m M,2 h,再加入MG,1 m M,1 h）。采用抗AGEs抗体行免疫点印记检测整体蛋白糖化水平、免疫沉淀检测AMPKγ2糖化程度以及蛋白免疫印迹检测p AMPK/AMPK,p ACC/ACC水平。4.将6月龄3×Tg-AD雌雄小鼠随机分为三组:Saline组,Arg-Low组,Arg-High组,进行45天的隔天腹腔注射给药:对照组（Saline组）注射生理盐水;Arglow组小鼠每斤体重注射0.3 mg精氨酸;Arg-high组小鼠每斤体重注射0.5 mg精氨酸。用新事物识别（Novel Object Recognition,NOR）行为学方法检测小鼠认知功能（C57BL/6,n=10;Saline,n=8;Arg-Low,n=10;Arg-High,n=9）。实验前两天分别让小鼠熟悉环境以及环境内两个事物,第三天移动其中一个物体至新方位,记录小鼠探索两个事物的时间。水迷宫（Morris Water Maze,MWM）检查小鼠学习记忆能力（C57BL/6,n=5;Saline,n=5;Arg-Low,n=8;Arg-High,n=8）。将7.5月龄小鼠安乐死取脑。采用免疫点印记检测小鼠脑蛋白的糖化水平,免疫沉淀特异性检测AMPKγ2亚基糖化水平以及蛋白免疫印迹检测p AMPK/AMPK,p ACC/ACC水平和APP蛋白、Tau 5及其不同位点的磷酸化的水平。研究结果1.WB显示相比于野生型C57BL/6,3×Tg-AD模型小鼠p AMPK表达水平明显降低（p＜0.05）,小鼠海马蛋白AGEs含量显著上升（p＜0.05）,海马AMPKγ2亚基糖化水平明显升高。2.在37℃恒温下,将D-glucose或是MG和蛋白的混合液与不同浓度精氨酸共孵育,DB显示随着精氨酸浓度的增加,AGEs的含量逐渐减少。3.N2a细胞实验中,相比于MG处理组,MG+Arg组的AMPKγ2亚基糖化显著性下降,并且其p AMPK及p ACC水平明显上调（p＜0.05）。4.3×Tg-AD模型鼠中,相比于生理盐水处理组,精氨酸处理组的AMPKγ2亚基糖化显著减少,且p AMPK（p＜0.01）及p ACC（p＜0.05）水平明显升高。5.水迷宫及新事物识别实验显示,精氨酸组3×Tg–AD转基因鼠相比于其生理盐水（Saline）组,小鼠的潜伏期显著缩短（p＜0.0001）,平台穿越次数明显增加（p＜0.0001）,探索新方位事物的时间明显增加（p＜0.05）。研究结论1.AD转基因小鼠pAMPK下降,AD鼠脑内包括AMPKγ2亚基在内的整体蛋白糖化水平显著增加。2.精氨酸明显地抑制蛋白糖化且呈现剂量依赖关系。3.降低AD模型的AMPKγ2亚基糖化可以提高p AMPK水平,有效缓解AMPK酶活性调节反应性异常,逆转AD样病理及认知障碍。