血液病是原发于造血系统,或影响造血系统伴以血液异常改变,以贫血、出血、发热为特征的疾病。血液病的发病率有逐年增高的趋势,化学因素、物理因素、生物因素等都可直接或间接成为血液病发病的诱因。近年来,现代医学对血液病的治疗多应用激素、化疗等疗法,但副作用大,病人治愈率低、易复发。有研究发现中性粒细胞减少是血液病易感染的最主要因素。而巨噬细胞中可以分泌各种不同的细胞因子,其中有促红细胞生成素,集落刺激因子等,对造血系统的修复有一定的作用。　　 巨噬细胞起源于骨髓,先发育成前体祖细胞后进入血液循环,穿出血管壁进入组织后分化为成熟巨噬细胞。巨噬细胞的主要功能包括分解各种异物,刺激和增进淋巴细胞的免疫活性；杀伤和清除肿瘤细胞和某些微生物；以及调节免疫应答。巨噬细胞起源于骨髓干细胞,反过来可作用于造血干细胞的发生和发育。巨噬细胞在血细胞发生中的作用越来越受到重视,但是其作用机制还需要进一步的研究。　　 根据巨噬细胞在组织中分布的部位不同,可分为腹腔巨噬细胞,外周血单核细胞,肺巨噬细胞,肝巨噬细胞和脾巨噬细胞等。目前关于小鼠的巨噬细胞与血细胞发生之间关系的研究主要是腹腔巨噬细胞,肺巨噬细胞对血细胞发生的影响,而对于肝脏和脾脏中巨噬细胞对血细胞发生的作用尚未有比较系统的研究报告。　　 本研究从小鼠组织器官肝和脾中通过机械剪切和胰蛋白酶、胶原酶消化的方法原代提取组织中的单个细胞,经不连续密度梯度离心和选择性反复贴壁法纯化得到巨噬细胞,将纯化细胞培养后取其上清液。应用脾集落技术和体外造血祖细胞培养技术检测肝和脾巨噬细胞对多能造血干细胞和造血祖细胞的增殖分化的作用,为进一步探讨巨噬细胞(MΦ)在血细胞发生发育过程中的作用机制提供实验基础。　　 材料和方法：　　 1.肝和脾巨噬细胞的提取纯化　　 颈椎脱臼处死小鼠,取肝脏和脾脏,经过机械剪切,胶原蛋白酶和胰蛋白酶消化、percoll不连续密度梯度离心、选择性贴壁等实验方法从昆明系小鼠体内原代提取出巨噬细胞,经胎盘蓝染色和墨汁吞噬实验检测肝和脾巨噬细胞活性和纯度。　　 2.肝和脾巨噬细胞对造血干细胞的影响　　 培养纯化后的肝和脾巨噬细胞,取其上清液,用其孵育正常小鼠体内的骨髓细胞。将实验分为五组,正常对照组、辐射对照组、注正常骨髓细胞实验组、经肝巨噬细胞孵育的实验组、经脾巨噬细胞孵育的实验组。将骨髓细胞经尾静脉注射入正常小鼠和经60Coγ(8.0GY)射线照射小鼠模型体内,饲养9天后,杀鼠取脾脏,称重并观察统计脾集落数。　　 3.肝和脾巨噬细胞对各系造血祖细胞的影响　　 取肝和脾巨噬细胞上清液分别加到BFC-E(早期红系集落单位)、CFC-E(红系集落单位)、CFC-GM(粒单系集落单位)、CFC-Meg(巨核系集落单位)培养体系中,用甲基纤维素半固体培养法培养3～14天,实验分为对照组和实验组,实验组分为培养体系中含有肝和脾巨噬细胞体积浓度为5％、10％、15％不同的体积浓度组。染色,在倒置显微镜下观察培养体系中不同分化程度的各造血祖细胞集落数。　　 4.肝和脾巨噬细胞对外周血的影响　　 应用现代血液学方法,将实验分为五组,正常对照组、辐射对照组、注正常骨髓细胞实验组、经肝巨噬细胞孵育的实验组、经脾巨噬细胞孵育的实验组。将骨髓细胞经尾静脉注射入正常小鼠和经60Coγ(6.0GY)射线照射小鼠模型体内,7天后取血计数血红蛋白,血小板,白细胞。检测巨噬细胞对经60Coγ(6.0GY)射线照射小鼠模型外周血的影响。　　 5.统计学处理　　 所有结果用均数±标准差(x±s)表示,所有数据由SPSS11.5统计软件处理,采用单因素方差分析(ANOVA),p<0.05则可认为有显著性差异。　　 结果：　　 1.肝和脾巨噬细胞的提取纯化　　 所提取细胞经过筛选提纯,通过胎盘蓝和墨汁吞噬实验检测,实验结果显示巨噬细胞的活性和纯度可达90％以上,且提取细胞为巨噬细胞。　　 2.肝和脾巨噬细胞对造血干细胞影响　　 经过对脾重的称量和脾表面集落数的统计显示,注正常BMC实验组的脾重(122±5.42 mg)和脾集落数(13.3±2.7),注肝MΦ孵育BMC实验组的脾重(130±5.63 mg)和脾集落数(23.4±4.6),注脾MΦ孵育BMC实验组的脾重(126±7.55 mg)和脾集落数(18.5±3.2)与正常对照组的脾重(113±6.98mg)和脾集落数(0),辐射对照组的脾重(121±3.68 mg)和脾集落数(0.7±0.9)相比,脾重增加,脾集落数增加。注肝MΦ孵育BMC实验组,注脾MΦ孵育BMC实验组与注正常BMC实验组相比有统计学差异。(p<0.05)　　 3.肝和脾巨噬细胞对造血祖细胞影响　　 红系爆式集落形成单位(BFU-E)注5％、10％、15％肝巨噬细胞的BFU-E培养体系实验组(35.0±3.0、47.0±4.7、48.0±7.2)、注5％、10％、15％脾巨噬细胞的BFU-E培养体系实验组(34.0±2.6、46.5±3.3、46.7±2.58)与对照组(33.7±4.8)相比,集落数随巨噬细胞体积浓度的增加而增加,有统计学差异。(p<0.05)　　 红系集落形成单位(CFU-E)注5％、10％、15％肝巨噬细胞的CFU-E培养体系实验组(52.3±2.5、63.3±5.7、67.7±2.3)注5％10％15％脾巨噬细胞的CFU-E培养体系实验组(47.2±2.7、57.7±3.6、57.8±1.5)与对照组(45.3±2.8)相比,集落数随巨噬细胞体积浓度的增加而明显增加。(p<0.05)　　 粒单系集落形成单位(CFU-GM)注5％、10％、15％肝巨噬细胞的CFU-GM培养体系实验组(84.2±4.2、97.8±3.7、101.3±6.2)注5％10％15％脾巨噬细胞的CFU-GM培养体系实验组(83.2±2.5、97.3±4.3、100.2±6.9)与对照组(73.3±2.8)相比,集落数随巨噬细胞体积浓度的增加而增加,且有统计学差异。(p<0.05)　　 巨核系集落形成单位(CFU-Meg)注5％、10％、15％肝巨噬细胞的CFU-Meg培养体系实验组(19.8±1.5、28.0±4.2、28.7±4.2)注5％10％15％脾巨噬细胞的CFU-Meg培养体系实验组(20.5±2.7、31.3±4.0、32.0±3.6)与对照组(15.7±2.3)相比,集落数随巨噬细胞体积浓度的增加而增加。(p<0.05)　　 肝和脾巨噬细胞对BFU-E、CFU-E、CFU-GM、CFU-Meg均有增强作用,并且巨噬细胞体积浓度与集落数成正相关性。　　 4.肝和脾巨噬细胞上清液对外周血影响　　 血液学检测显示:注肝MΦ孵育BMC实验组血红蛋白(122.9±14.61g/L)、白细胞(34.3±4.74×108个/L)、血小板数(34.4±9.11×109个/L),注脾MΦ孵育BMC实验组血红蛋白(99.5±7.35 g/L)、白细胞(32.0±3.97×108个/L)、血小板数(29.9±4.25×109个/L)与注正常BMC实验组血红蛋白(80.2±12.76 g/L)、白细胞(26.4±2.22×108个/L)、血小板数(21.9±5.74×109个/L)相比显著增加(p<0.05)。肝和脾巨噬细胞可促使经60Coγ(6.0Gay)射线照射后小鼠外周血中血红蛋白、白细胞、血小板数较辐射对照组有所增加,外周血的增殖效率显著增加。(p<0.05)　　 结论：　　 1.改进了提取纯化小鼠肝和脾巨噬细胞的实验方法。　　 2.肝和脾巨噬细胞对造血干细胞、造血祖细胞、外周血细胞有一定的增殖作用。　　 3.提示了肝和脾巨噬细胞中有对血细胞的发生起起重要的作用的细胞因子。