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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称金葡菌)是临床上分离率最高的革兰阳性病原菌。除引起皮肤和软组织感染外,也可引起致死性肺炎、骨髓炎、败血症和感染性心内膜炎等严重危害人类健康的疾病。近年来,由于抗生素在临床上的广泛使用,金葡菌的耐药性问题引起了广泛关注,尤其是耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistant S.aureus,MRSA)的出现和流行,给临床治疗金葡菌引起的感染带来了严峻挑战。MRSA几乎对临床常用的所有β-内酰胺类抗生素耐药。然而,在MSRA菌株被分离鉴定之前,临床上β-内酰胺类抗生素常作为革兰阳性菌感染治疗的经验用药,当遇到MRSA感染患者时,β-内酰胺类抗生素不但不能发挥有效的治疗效果,亚抑菌浓度的β-内酰胺类抗生素反而可能促进MRSA毒力基因的表达,导致感染恶化。已有研究表明,亚抑菌浓度的β-内酰胺类抗生素可以诱导金葡菌α溶血素,杀白细胞素(PVL)、葡萄球菌蛋白A(SpA)等毒力因子表达,增强MRSA的致病性。迄今为止,β-内酰胺类抗生素诱导MRSA毒力因子表达在体内是否能促进MRSA的致病性仍不清楚。因此,探索β-内酰胺类抗生素诱导MRSA毒力基因表达的分子机制及其在宿主体内促进MRSA的致病作用,对合理选用抗生素,有效防控MRSA感染具有重要的现实意义。金葡菌毒力因子的表达调控中,葡萄球菌附属调控系统sar(staphylococcal accessory)和附属基因调控子agr(accessory gene regulators)发挥全局性调控作用。SarA是金葡菌中一种分子量为14.7 kDa的多能性调控分子,可以与靶基因启动子区域特定的序列结合,通过agr依赖或非依赖方式调控金葡菌约120种基因的表达,涉及细菌定植、致病、生物被膜形成及耐药性等多种生物学过程。脂蛋白(lipoproteins,Lpps)是锚定于细菌细胞膜上的重要功能蛋白。金葡菌基因组中拥有55-70种Lpps的编码基因,除了参与细胞膜稳定、物质转运、生物信号传递外,金葡菌部分Lpps也可分泌到菌体外,酰基化的Lpps能与宿主天然免疫细胞表面的TLR2受体结合,激活TLR2依赖的天然免疫系统,诱导宿主炎症反应,增强细菌致病性等。目前,金葡菌中约30%的Lpps功能不清,且有约21%的Lpp基因被命名为脂蛋白样基因(lipoprotein-like genes,lpl)。例如,MRSA N315株可编码12种Lpls,其中9种的编码基因位于νSaα。有研究表明,一些Lpls可能与金葡菌刺激机体的炎症因子表达及细菌的致病性密切相关,但特定Lpls的确切生物学功能及其调控机制不清。本研究在MRSA菌株中发现一簇受亚抑菌浓度β-内酰胺类抗生素诱导的lpl基因,并对其表达调控机制及在促进MRSA致病性中的作用进行研究,为临床合理使用抗生素提供了新的依据。主要研究内容和结果如下:一、亚抑菌浓度β-内酰胺类抗生素诱导MRSA菌株串联脂蛋白表达的作用1.β-内酰胺类抗生素对MRSA菌株蛋白的诱导作用与Lpls鉴定:MRSA菌株经不同抗生素诱导培养,SDS-PAGE电泳发现,亚抑菌浓度β-内酰胺类抗生素诱导后,细菌在约30 kDa处出现一条明显上调表达的蛋白条带。我们利用质谱技术(LC-MS/MS)对β-内酰胺类抗生素诱导表达的蛋白条带进行鉴定分析,发现一个lpl基因簇,分别编码SA2273,SA2274和SA2275三个高度同源的串联脂蛋白。RT-PCR分析发现这3个基因可以共同转录,由一个操纵子控制。2.β-内酰胺类抗生素诱导MRSA菌株lpl的转录与表达分析:RT-qPCR检测发现,亚抑菌浓度OXA可以诱导MRSA菌N315株lpl基因簇的转录。Western blot结果证实,亚抑菌浓度β-内酰胺类抗生素可以有效诱导MRSA菌株表达并分泌Lpls,且存在剂量和时间依赖效应。二、β-内酰胺类抗生素通过SarA促进MRSA菌株Lpls表达的作用与机制1.SarA介导β-内酰胺类抗生素促进MRSA菌株Lpls表达的作用研究:RT-qPCR检测发现OXA可以诱导MRSA N315株全局调控因子agrA,sarA和RNAIII的转录。进一步Western blot检测发现,SarA通过非agr依赖途径调控Lpls的表达。2.SarA介导β-内酰胺类抗生素促进MRSA菌株Lpls表达的机制研究:通过构建lpl启动子控制的lacZ基因报告质粒(pOS1-lpl~P),分别在N315和N315ΔsarA株中检测lpl启动子的转录活性,发现SarA可显著影响lacZ报告基因表达。再通过Western blot明确SarA对Lpls的正调控作用。利用生物信息学方法在lpl启动子区预测出保守的SarA结合位点(5`-ATTTAAT-3`)。凝胶迁移阻滞实验(EMSA)证实,SarA可直接与MRSA菌株lpl基因簇启动子区结合,参与β-内酰胺类抗生素诱导MRSA菌株lpl的表达调控。三、β-内酰胺类抗生素诱导MRSA表达之Lpls发挥TLR2依赖的促炎作用1.Lpls刺激巨噬细胞TLR2依赖的促炎作用研究:为研究β-内酰胺类抗生素诱导的Lpls是否在介导MRSA刺激天然免疫细胞炎症因子的表达中发挥重要作用,我们用构建的lpl敲除株及过表达菌株刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7,发现lpl敲除可以显著降低MRSA菌株刺激细胞炎症因子表达的能力。再分别用重组的SA2275-his和未酰基化的SA2275-his(-sp)蛋白进行巨噬细胞刺激实验,发现Lpls在细胞水平可发挥TLR2依赖的促炎作用,且该作用依赖Lpls完整的酰基基团。2.Lpls刺激小鼠TLR2依赖的促炎作用研究:动物实验进一步证实,β-内酰胺类抗生素诱导的Lpls在小鼠体内同样发挥TLR2依赖的促炎作用。四、β-内酰胺类抗生素诱导Lpls表达增强MRSA的致病性1.Lpls增强MRSA在小鼠肾脏中的定植:为研究β-内酰胺类抗生素诱导Lpls在MRSA致病性中的作用,小鼠经尾静脉注射感染pGFP质粒标记的N315和N315Δlpl,5天后检测脏器中的细菌数目,发现lpl敲除显著降低MRSA在小鼠肾脏中的定植,表明Lpls在MRSA感染小鼠肾脏的定植中发挥重要作用。2.Lpls增强MRSA感染所致小鼠皮肤脓肿的形成:通过构建小鼠皮肤感染治疗模型,证实β-内酰胺类抗生素在体内诱导Lpls表达并促进MRSA感染所致小鼠皮肤脓肿的形成,且具有TLR2受体依赖性。综上所述,本研究在MRSA菌株中发现并鉴定了一簇受亚抑菌浓度β-内酰胺类抗生素诱导表达的脂蛋白样基因簇(sa2275,sa2274,sa2273),其表达依赖于金葡菌全局调控因子SarA;β-内酰胺类抗生素处理首先诱导MRSA菌株SarA的表达升高,SarA与lpl基因簇启动子区特定序列结合,正调控该基因簇的表达;上调表达的Lpls能激活TLR2依赖的信号通路,在体内和体外均能促进炎症因子的大量表达,进而诱导宿主产生过度炎症应答并促进细菌的定植,增强MRSA的致病性。研究结果提示,临床上应根据药敏试验结果合理选用抗生素,因经验性使用的β-内酰胺类抗生素在遇到MRSA感染情况下,不但不能发挥有效的治疗效果,且随着药物在患者体内的代谢,亚抑菌浓度的β-内酰胺类抗生素还可能促进Lpls表达而增强MRSA致病性,导致病情恶化。