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目的明确云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类自然感染嗜吞噬细胞无形体状况及多种因素对野外小型兽类感染嗜吞噬细胞无形体的影响,探讨云南鼠疫自然疫源地嗜吞噬细胞无形体流行株基因多态性,为疾病防控提供科学依据。方法1.样本来源本研究于云南鼠疫自然疫源地捕获野外小型兽类2611只,对捕获的野外小型兽类进行肝、脾脏器样本采集,共获得2549份肝、脾脏器样本,通过分层抽样,1605份样本作为本次实验检测对象。2.DNA提取按照磁珠法微量细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书的操作步骤对野外小型兽类肝、脾脏器样本进行DNA提取,通过核酸浓度测定仪NanoDrop-1000对提取的样本DNA进行检测,不符合标准的样本DNA重新进行提取,对符合标准的样本DNA进行PCR扩增。3.PCR扩增采用巢式PCR进行嗜吞噬细胞无形体16SrRNA基因片段扩增,采用实时荧光定量PCR进行嗜吞噬细胞无形体gltA基因片段扩增。4.基因序列测定和系统进化树分析将测序成功的样本基因序列片段通过登陆网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)利用BLAST中的“Sequence Similarity Searching”功能进行比对,并将相对应的嗜吞噬细胞无形体序列进行下载,使用MEGA7.0生物软件建立相应基因序列的系统发育树并进行分析。5.资料的整理和分析应用Excel2007软件将鉴定后的野外小型兽类信息资料进行录入、整理;应用R软件对数据资料进行统计学分析,采用Chi-square Test,Fisher’s Exact Test比较不同地区、鼠种、海拔梯度、性别、生境及季节间野外小型兽类嗜吞噬细胞无形体感染情况,检验水准为α=0.05。结果1.1605只野外小型兽类样本涉及3目6科19属30种;其中,齐氏姬鼠(Apodemus chevrieri)数量最多,构成比占到29.35%(471/1605);其次为大绒鼠(Eothenomys mileyus)构成比为19.00%(305/1605);其余鼠种构成比均小于10%。2.云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类嗜吞噬细胞无形体感染率为0.93%(15/1605);梁河疫源地嗜吞噬细胞无形体感染率3.19%(13/407)显著高于玉龙疫源地0.36%(2/550)和剑川疫源地0%(0/648)(c~2=30.493,(49)<0.001);家鼠鼠疫自然疫源地嗜吞噬细胞无形体感染率3.19%(13/407)显著高于野鼠鼠疫自然疫源地0.17%(2/1198)(c~2=26.888,(49)<0.001)。3.云南鼠疫自然疫源地共有5种野外小型兽类感染了嗜吞噬细胞无形体,感染率分别为齐氏姬鼠0.21%(1/471)、大绒鼠0.33%(1/305)、黄胸鼠5.77%(6/104)、斯氏家鼠4.88%(4/82)和大足鼠20%(3/15);构成比小于10%的鼠种嗜吞噬细胞无形体感染率1.57%(13/829)显著高于优势鼠种0.26%(2/776)(c~2=7.434,(49)=0.006)。4.玉龙疫源地四个海拔梯度(2400~2600m、2600~2800m、2800~3000m及≥3000m)野外小型兽类嗜吞噬细胞无形体感染率分别为0%(0/61)、1.32%(1/76)、0%(0/104)及0.32%(1/309);玉龙疫源地不同海拔梯度野外小型兽类嗜吞噬细胞无形体感染率无统计学差异((49)=0.472)。剑川疫源地三个海拔梯度(2250~2450m、2450~2650m及2650~2850m)野外小型兽类嗜吞噬细胞无形体感染率均为0。梁河疫源地四个海拔梯度(1000~1200m、1200~1400m、1400~1600m及≥1600m)野外小型兽类嗜吞噬细胞无形体感染率分别为5.13%(6/117)、4.20%(5/119)、1.82%(2/110)及0%(0/61);梁河疫源地不同海拔梯度野外小型兽类嗜吞噬细胞无形体感染率无统计学差异((49)=0.219)。5.野外小型兽类在春季、夏季、秋季及冬季嗜吞噬细胞无形体感染率分别为1.95%(7/359)、0.27%(1/368)、0.64%(3/469)及0.98%(4/409),不同季节野外小型兽类嗜吞噬细胞无形体感染率无统计学差异((49)=0.130)。6.野外雌性和雄性小型兽类嗜吞噬细胞无形体的感染率分别为0.67%(5/747)和1.17%(10/852),感染率无统计学差异(c~2=1.090,(49)=0.297)。7.在林地捕获的野外小型兽类嗜吞噬细胞无形体感染率为1.45%(15/1036),而在耕地、灌丛、耕地林地交界以及耕地灌丛交界野外小型兽类嗜吞噬细胞无形体感染率均为0,不同生境野外小型兽类嗜吞噬细胞无形体感染率无统计学差异((49)=0.217)。8.进化分析表明,除来自玉龙疫源地YL-3-279样本外,其余阳性样本基因序列与中国东北(GQ412339.1)、俄罗斯(HM366583.1)、浙江(HM439430.1)、吉林(DQ449948.1)、加拿大(HG916766.1)、云南(MF134887.1)、安徽(EF211110.2)等地不同宿主动物(如鼠、蜱等)感染嗜吞噬细胞无形体株聚在同一分枝;与日本(AB196721.1)及韩国(AF70699.1)的嗜吞噬细胞无形体株具有较高的同源性,同属一个大分枝,但相距较远;YL-3-279则单独聚在一分枝;其它无形体属成员湖北(HM538192.1)边缘无形体(A.marginale)及意大利(EF520690.1)中央无形体(A.centrale)聚在同一分枝;美国(DQ150682.1)立克次体(Rickettsia rickettsii)则处于外围。这说明检出的嗜吞噬细胞无形体株具有基因多样性并存在一定地域差异。9.实时荧光定量PCR实验检测嗜吞噬细胞无形体gltA基因序列的测序结果显示:全部测序样本基因序列均非嗜吞噬细胞无形体gltA基因片段序列。结论1.云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类嗜吞噬细胞无形体感染率为0.93%(15/1605),家鼠鼠疫自然疫源地嗜吞噬细胞无形体感染率显著高于野鼠鼠疫自然疫源地。2.云南鼠疫自然疫源地的齐氏姬鼠、大绒鼠、黄胸鼠、斯氏家鼠和大足鼠感染了嗜吞噬细胞无形体。3.云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类感染的嗜吞噬细胞无形体株具有基因多样性并存在一定地域差异。