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目的:
研究胃癌手术后患者在接受卡培他滨联合奥沙利铂化疗前、后免疫细胞数量、亚群比例、细胞表型及功能的变化,检测化疗前、后胃癌患者淋巴细胞对人胃癌细胞株NCI-N87杀伤能力的改变,并探讨其临床意义,为临床化疗及开展免疫生物治疗提供理论和实验依据。
方法:
Ⅰ.体内实验.17例次(8例)胃癌患者接受卡培他滨联合奥沙利铂化疗免疫生物治疗后,对其化疗前、后的白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞进行计数,流式细胞仪检测其外周血PBMC中T淋巴细胞亚群比例变化。
1.收集患者在化疗前(1~5d)、化疗后早期(4~7d,stage1,S1)、化疗后晚期(9~11d,stage2,S2)三个不同阶段的临床血样检验数据,对白细胞、中性粒细胞以及淋巴细胞的绝对数进行计数、分析;
2.收集化疗患者在化疗前(1~5d)、化疗后10天左右两个阶段的临床血样检验数据,流式细胞仪监测外周血淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+T细胞比例及CD4+/CD8+的比值:
3.流式细胞仪检测胃癌患者化疗前、后外周血T细胞表达CD44的情况,再以CD62L为标记检测化疗前、后PBMC中CD4+CD62Llow,CD8+CD62Llow T细胞比例了解胃癌患者化疗后能否诱生记忆样表型的T淋巴细胞。
Ⅱ.体外实验,分离胃癌患者化疗前及化疗后10天左右的外周血淋巴细胞,PHA-L培养48h,观察体外培养后的外周血淋巴细胞对人胃癌NCI-N87细胞的杀伤效应:
1.采用CCK-8法检测与化疗前、后患者外周血淋巴细胞对人胃癌NCI-N87细胞的杀伤作用。
2.分离胃癌患者化疗前、化疗后10天左右的外周血淋巴细胞,用PHA培养48 h后,以NCI-N87细胞为靶细胞,用流式细胞仪检测淋巴细胞对NCI-N87细胞的杀伤作用。
结果:
1.体内实验:1.与对照组相比所有样本的白细胞、中性粒细胞及淋巴细胞数目在化疗后4~7d明显下降,在化疗后9~11d又恢复至正常的变化规律,在化疗后4~7d所有样本淋巴细胞数目平均值小于1000/μl,符合淋巴细胞减少症的标准。提示胃癌患者化疗后均不同程度地存在淋巴细胞减少症,随后出现淋巴细胞减少驱动的淋巴细胞增生。
2.化疗前患者外周血PBMC中CD3+细胞比例平均为(65.50±13.59)%;化疗后(S2)为(67.67±15.16)%,P>0.05。进一步分析T细胞中CD4+、CD8+T细胞比值,结果发现,化疗后CD4+/CD8+比值下降(化疗前为1.21±0.63,化疗后为1.02±0.65,P>0.05)。
3.化疗前、后CD4+T细胞CD44平均荧光强度分别为201.25±25.17和449.11±30.17; CD8+T细胞CD44平均荧光强度为307.54±32.45和457.94±26.77,P<0.05;化疗前、后PBMC中CD4+ CD62Llow,CD8+ CD62LlowT细胞比例,化疗前为(20.13±2.36)%和(24.46±1.37)%;化疗后为(45.44±3.89)%和(45.68±4.13)%。提示化疗9~11d时患者外周血T淋巴细胞中记忆样表型的T细胞(CD44+ CD62Llow)比例增加。
Ⅱ.体外实验:1.人胃癌NCI-N87细胞与化疗后增生的T淋巴细胞共同培养48小时后平均杀伤率为12.61±1.36%,与化疗前平均14.36±1.68%相比,P>0.05,提示化疗后淋巴细胞对人胃癌NCI-N87的杀伤作用并未明显减弱。
2.结果显示,PBMC体外PHA活化后增生明显;化疗后平均杀伤率为6.55%,与化疗前平均为6.96%相比,P>0.05,无统计学意义,杀伤功能并未受到抑制。另外我们观察到一个有趣的现象:1例样本化疗后淋巴细胞杀伤功能上调较明显(化疗前为6.25%,化疗后为11.21%)。
结论:
1.胃癌术后患者化疗后均不同程度地存在淋巴细胞减少,随后出现代偿性的淋巴细胞增生。
2.化疗没有降低患者PBMC中T细胞的比例,化疗后淋巴细胞恢复过程中T细胞相对比例增加:其中CD4+/CD8+比值下降,表示CD8+T细胞增生较CD4+T细胞相对明显。
3.胃癌术后患者化疗后,淋巴细胞自稳增生性过程能够诱生记忆样表型T淋巴细胞。
4.化疗后的T淋巴细胞免疫杀伤功能较化疗前并无明显下降。