论文部分内容阅读
目的：（1）建立紫杉醇含量测定方法；分离人血浆低密度脂蛋白（LDL）；（2）合成癸酸接枝的精氨酸改性壳聚糖（ACD）。（3）制备包载紫杉醇（PTX）的聚合物胶束（PTX-ACD）并用LDL对其进行修饰，对两种载药胶束进行表征并对其释放度进行考察。（4）对LDL修饰的载紫杉醇胶束（PTX-LDL-ACD）的体内急性毒性，A549细胞移植瘤裸鼠的抗肿瘤活性及体内靶向性进行考察，并与紫杉醇注射剂（PTX-INJ）进行比较。（5）评价新型载药系统PTX-LDL-ADC胶束的体外药效。对PTX-LDL-ADC的体外细胞毒性、细胞摄取和细胞凋亡进行考察，并与PTX-ADC及原料药进行比较。方法：（1）采用高效液相色谱法建立紫杉醇的含量测定方法；溴化钾密度梯度离心法从人血浆中分离LDL并对其进行表征；（2）分别用IR、1H NMR、广角x射线衍射（WAXD）和差示扫描量热法（DSC）等技术对壳聚糖衍生物结构进行表征，并考察其在各种溶剂中的溶解性能及其对难溶性药物的增溶能力。（3）初步筛选载药胶束的制备方法，并对其制备工艺进行优化；采用EDC·HCl和NHS活化法将LDL接枝于胶束上；对其进行表征；透析袋法测定两种载药胶束的释放度。（4）利用小鼠急性毒性实验测定LD50。建立动物肿瘤模型，绘制在体肿瘤生长曲线，计算各组裸鼠的抑瘤率。HE染色后进行病理组织学观察。构建了具备靶向性的Cy7-LDL-ACD，并对其体内靶向性进行研究。（5）MTT法求算肿瘤细胞抑制率IR。分别利用共聚焦显微镜、荧光显微镜观察胶束在A549细胞内的摄取和分布情况。利用荧光显微镜考察不同胶束诱导癌细胞凋亡的情况。结果：（1）建立了PTX的HPLC标准曲线，其回归方程为y=33.784x+6.073，R2=0.99996， PTX浓度在0.5～200μg·mL-1范围内线性良好。分离得到的LDL平均粒径为（28.7±5.1）nm，PDI为0.208，透射电镜下观察LDL的形态为圆整球状；应用Bradford法测得LDL蛋白浓度（未经浓缩）为0.808mg·mL-1。（2）所制得的两亲性嵌段共聚物精氨酸-壳聚糖-癸酸（ACD）的分子量约为8.3kD，荧光光谱法测得ACD临界胶束浓度约为3.299×10-2mg·mL1；溶解度实验表明其在pH1～12溶液中均可溶解，并可在水中自组装形成带有淡蓝色乳光的胶束溶液；（3）选取超声法为本实验载药胶束的制备方法并对其进行优化，得到最佳制备工艺为：ACD的浓度3mg·mL-1、药载比3∶10、超声次数200次。红外和凝胶电泳试验表明LDL成功接上载药胶束；其释放符合Higuchi方程，遵循骨架型释放模型特点。马尔文粒径测定仪显示系列ARG-CS-DA形成的聚合物胶束平均粒径为166.3nm，多分散系数为0.2，Zeta电位为+21.75～+29.80mV。（4）PTX-ACD及PTX-LDL-ACD组小鼠尾静脉注射的LD50及其95%可信限，分别为65.36(40.92~94.70) mg·kg-1和70.81(44.33~102.59) mg·kg-1。PTX-LDL-ACD组小鼠尾静脉注射的LD50为PTX-INJ组的2.4倍，PTX-ACD组小鼠尾静脉注射的LD50为PTX-INJ组的2.2倍。肿瘤抑制强弱顺序为：PTX-LDL-ACD>PTX-ACD> PTX-INJ，其中PTX-LDL-ACD抑瘤率达到63.42%。尾静脉给药1h后，2种胶束在体内均可全身弥散，6h内肿瘤部位可见较为集中的荧光分布；在12h内，可较为明显的观察到胶束在裸鼠肝脏与肿瘤部位集中；72h内PTX-LDL-ACD组裸鼠肿瘤部位仍可观察到较强的荧光。（5）载药胶束的细胞毒性PTX-LDL-ADC>PTX-ADC>PTX；细胞摄取PTX-LDL-ADC>PTX-ADC；对细胞凋亡的影响PTX-LDL-ADC>PTX-ADC>PTX。结论：成功建立了紫杉醇的HPLC含量测定方法；分离得到纯度较高的LDL；制备了PTX-ACD载药胶束，并将LDL成功连接到胶束上。PTX载药胶束具有增加药物溶解性、减缓药物释放的作用。急性毒性实验表明，PTX-ACD和PTX-ACD-LDL比PTX-INJ具有更低的毒性。抑瘤实验说明，LDL修饰的胶束的抑瘤效果更好。靶向性实验说明，Cy7标记的LDL-ACD在活体荧光显像中具有更明显的靶向性。与泰素和未经靶头修饰的载药胶束相比，经低密度脂蛋白（LDL）修饰后的壳聚糖纳米粒靶向主动的与癌细胞上过表达的低密度脂蛋白受体（LDLR）相结合，细胞毒性显著增加。