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一、研究背景与目的大黄素是存在于大黄和何首乌等药材中的天然蒽醌类物质,具泻下、抗菌、抗炎、抗肿瘤和保护肝肾等作用,因而受到了广泛的关注和研究。然而大黄素对肝脏具双重作用,小剂量起保护作用,大剂量产生毒性。目前关于大黄素代谢与毒性的关系尚不明确,本研究主要考察以下科学问题:①大黄素的肝细胞毒性及细胞色素P450(Cytochromes P450,CYPs)介导的I相代谢对毒性的影响;②葡萄糖醛酸化转移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGTs)介导的Ⅱ相代谢对毒性的影响及转录因子对关键UGT酶的调控;③大鼠长期摄入大黄素致肝毒性具性别差异的机制;④丙磺舒合用大黄素对大鼠肝毒性的影响及机制。为大黄素的临床合理使用提供一定的理论基础和科学依据。二、研究方法1.采用HepG2细胞模型探讨大黄素的肝细胞毒性,并采用CYP1A2/3A4的抑制剂和诱导剂,考察Ⅰ相代谢对毒性的影响。2.结合体外UGTs纯酶实验、55例人肝/36例人肾样本的基因组和转录组学数据探究参与大黄素Ⅱ相代谢的体内主要UGT酶。分别敲低HepG2细胞中UGT2B7和转录因子HNF4A,探讨Ⅱ相代谢与毒性的关系及HNF4A对UGT2B7的调控。3.雌雄大鼠随机分为对照组、阳性组、高剂量组(150 mg/kg/d)和低剂量组(60mg/kg/d),连续灌胃给药28天,探讨大黄素的肝毒性具性别差异的机制。4.大黄素和丙磺舒联合作用于大鼠(灌胃28天)及细胞上(给药48 h),探讨合用丙磺舒对大黄素肝毒性和细胞毒性的影响及机制。三、结果与结论1.高浓度大黄素抑制细胞生长,同时可诱发氧化应激和耗竭还原型谷胱甘肽,外源性补充还原型谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸可减轻大黄素对细胞生长的抑制作用。CYP1A2/3A4抑制剂增加大黄素的细胞毒性,CYP1A2/3A4诱导剂降低大黄素的细胞毒性,因此CYP1A2/3A4介导的大黄素Ⅰ相代谢起解毒作用。2.UGT2B7是大黄素的体内主要ⅡI相代谢酶,4个新基因突变位点rs12186237、rs56724509、rs135297 和 rs11726899 显著影响大黄素 Ⅱ 相代谢。大黄素毒性大于其Ⅱ相代谢物毒性,因此UGT2B7介导的Ⅱ相代谢起解毒作用。高浓度大黄素可同时抑制HNF4A和UGT2B7,而敲低HNF4A可显著下调UGT2B7,由此证实大黄素通过抑制HNF4A下调UGT2B7使代谢减弱,毒性增加。3.长期给予大剂量大黄素致大鼠性别差异性肝损伤,UGT2B7和多药耐药相关蛋白2(Multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)是导致肝损伤具性别差异的潜在机制之一。4.长期合用大黄素和丙磺舒致大鼠严重肝损伤(33.3%大鼠死亡)。丙磺舒通过抑制大鼠和细胞内UGT1A9、UGT2B7及MRP2的酶活性/表达,增加大黄素及其代谢物的血药浓度,进而加重大黄素诱导的肝损伤和细胞毒性。