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目的调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)属于CD4~+T淋巴细胞中表达转录因子Foxp3并具有调节其他多种免疫细胞功能的T细胞亚群,该细胞亚群的正常生理功能对体内免疫稳态维持必不可少。Treg的发育及功能失调与多种重大免疫相关性疾病的病理生理进程密切相关,其中在肿瘤发生发展过程中Treg介导的免疫抑制就是肿瘤免疫逃逸的一种关键机制。研究已经证明Treg对中晚期肿瘤的发展具有重要的促进作用,而且Treg数量或比例的变化对早期肿瘤形成也十分关键。因此,本研究的目的是利用大气环境污染物DMBA处理小鼠的经典致瘤模型,诱导皮肤癌,分析DMBA诱癌早期机体Treg增殖变化,并进一步探讨致癌物DMBA调控Treg增殖变化的分子机制。研究方法1.以致癌剂DMBA涂抹正常C57小鼠皮肤诱导的皮肤癌为实验模型,溶剂丙酮(acetone)涂抹作为对照,分别于不同时间点(day1-day6)涂抹皮肤,第六天取六组小鼠引流淋巴结制备单细胞,流式染色FACS检测分析DMBA诱癌早期引流淋巴结CD4~+T细胞中Foxp3~+细胞的数量及比例变化。2.acetone/DMBA分别涂抹处理C57小鼠后,六天后处死小鼠取淋巴结制备单细胞,FACS染色检测小鼠皮肤引流淋巴结中CD4~+T细胞中Treg的增殖有无变化及与哪种Treg亚群的增殖变化相关。3.流式细胞仪无菌分选Foxp3-GFP小鼠中CD4~+Foxp3-GFP~+T细胞和CD4~+Foxp3-GFP~-T细胞,体外用eFluor450荧光染料标记,分别尾静脉回输给C57BL/6小鼠,再分别涂抹acetone及DMBA,FACS检测四组经过不同处理的小鼠皮肤引流淋巴结中的CD4~+Foxp3-GFP~+T细胞和CD4~+Foxp3-GFP~-T细胞的比例及增殖情况。4.荧光抗体标记与Treg功能和稳定性相关因子,利用流式细胞仪检测acetone,DMBA处理后的小鼠引流淋巴结Treg中相关因子的表达水平变化。5.acetone或DMBA分别处理Foxp3-GFP小鼠,第六天分选不同组Treg,体外与eFluor450荧光标记的效应性T细胞共培养,四天后检测Treg对效应性T细胞的增殖影响。acetone或DMBA分别处理C57小鼠,六天后回输分选的OTII T细胞,回输三天后检测OTII T细胞的增殖变化情况。6.基因芯片测定不同处理组Treg基因转录差异,筛选细胞增殖相关差异基因,推测可能信号通路,选择相应的信号通路抑制剂,测定抑制剂处理后DMBA对Treg增殖变化的影响。结果1.DMBA处理后促进皮肤引流淋巴结内Treg的比例显著上升,Foxp3基因转录水平显著升高,这种Treg比例的上升是DMBA依赖性的,非致癌剂如Th1佐剂CpG和Th2佐剂papain不能引发类似现象。2.DMBA处理导致皮肤引流淋巴结内Treg的ki67表达明显升高,说明Treg比例升高是Treg增殖引起的,Helios~+Treg的增殖升高,说明是发育自胸腺的tTreg发生了增殖。3.DMBA处理后回输的CD4~+Foxp3-GFP~-T细胞没有转化成Foxp3-GFP~+T细胞,而回输CD4~+Foxp3-GFP~+T细胞的小鼠经DMBA处理后,该群细胞的增殖水平显著升高,进一步证明Treg的增殖是由于tTreg增殖导致的。4.DMBA处理后皮肤引流淋巴结内Treg抑制性功能分子CTLA4,GITR及与Foxp3稳定性相关的EOS分子表达水平均显著升高。5.DMBA处理后的Treg在体外、体内均可以显著抑制抗原刺激的CD4~+T细胞的增殖。6.基因芯片结果显示DMBA处理诱导的皮肤引流淋巴结tTreg的代谢相关细胞蛋白V-ATPase的关键亚基ATP6v0d2基因转录水平显著升高,V-ATPase及其调控的下游信号通路关键蛋白AMPK、mTORC1活性抑制剂抑制结果显示,阻断V-ATPase或AMPK可以有效阻断DMBA导致的tTreg扩增,而阻断mTORC1对tTreg扩增没有产生影响,因此推断DMBA处理诱导tTreg扩增可能是通过影响和调控了V-ATPase-AMPK代谢信号通路。结论致癌剂DMBA不但可以造成DNA损伤诱导肿瘤,而且DMBA在诱癌早期还可以诱导机体tTreg扩增,引起机体免疫抑制,促进肿瘤发生发展。其调控tTreg扩增的分子机制可能是激活了tTreg的V-ATPase-AMPK代谢信号通路。