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rocG基因是Bacillus subtilis基因组中编码谷氨酸脱氢酶(GlutDH)的基因,催化反应L-glutamate+H2O+NAD+=α-oxoglutarate+NH3+NADH,而α-酮戊二酸和谷氨酸的相互转换是所有生物体内氮代谢和碳代谢重要连接点,分析rocG基因对于枯草芽孢杆菌氮代谢的影响。
构建含有木糖诱导型启动子Pxyl的载体pUC18-2以及含有IPTG诱导型启动子Pspac的载体pUC18-C。载体构建过程中设计诱导型启动子替换rocG基因原启动子,在载体中插入奇霉素Spc基因,使用奇霉素作为抗性筛选。分别将载体整合到野生菌株B.subtilis168基因组中,研究rocG基因与野生菌株B.subtilis168的氮代谢相互关系。
通过Spizizen转化以单交换方式将pUC18-2以及pUC18-C整合到野生菌株B.subtilis168基因组中,通过PCR扩增的方式筛选转化子分别命名为168-P和168-E。对转化子的生理特性进行研究,发酵测定转化子的生长曲线、葡萄糖消耗速率和NH4+消耗速率,分析在不同诱导物诱导情况下rocG基因表达与菌株氮代谢的关系。利用M9培养基培养测定转化子生长曲线,木糖作用诱导不明显,这是因为受到葡萄糖效应抑制；不同IPTG诱导物浓度诱导效果差别不是很明显,这是由于rocG基因在低氨浓度条件下不是主要氮代谢途径。利用LB培养基培养测定转化子生长曲线,菌体生长量随不同木糖浓度增大而升高；不同IPTG诱导物浓度诱导产生明显差别,在设定的IPTG诱导物浓度范围内随诱导物浓度升高菌体量也逐渐升高。利用M9培养基培养测定转化子葡萄糖消耗速率,葡萄糖消耗速率随木糖浓度升高而降低；对于IPTG诱导来说在对数生长期IPTG浓度2.00mM葡萄糖消耗消耗速率最快,而IPTG浓度0.00mM葡萄糖消耗速率相对来说最慢。利用M9基本盐培养基发酵测定NH4+消耗速率,不同木糖诱导物浓度诱导条件下,菌株消耗NH4+曲线没有明显差异；不同IPTG诱导物浓度诱导,在处于M9低氮条件下菌株消耗NH4+曲线没有明显差异。