环境中低浓度铅暴露一般不引起典型的铅中毒，而主要表现为以学习记忆损害为主的神经毒性。 目前关于铅损害学习记忆机制普遍看法是(附图1-1)[13]：海马(谷氨酸兴奋性Schaffer-collateral→CA1和perforantpath→dentategyrus突触结构)是铅神经毒作用的靶器官，铅可破坏其结构和功能，干扰其正常代谢过程；铅可作用于LTP诱导和维持全过程，一方面铅改变NMDA受体亚单位组分，诱导NMDA受体亚单位NR2A与NR1mRNA(NR1-1和NR1-4)表达下降，使NMDA受体亚单位组分中以NR2B/NR1为主，另一方面铅改变NMDA受体在突触后膜树突棘PSD区域定位。从而使NMDA介导细胞内Ca2+→CaMKⅡ、PKC、MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)和nNOS(神经元NO合酶)钙敏感性信号酶的信号通路发生改变。最终导致学习记忆功能等神经系统损害。 NCAM起自70年代末期被初步确定以来，至今在其分子结构、基因定位及其功能属性等方面的研究已经取得了极大的进展。CatherineNguyen发现人、小鼠和大鼠的NCAM基因分别定位于第11号、第9号和第8号染色体。NCAM基因由内含子及26个外显子组成，这26个外显子在不同种属之间结构是相当恒定的，但内含子却各有差异。在NCAM基因序列中有多个部位是转录终止区，对不同区域的表达则形成不同的NCAM。NCAM属单基因家族，其各种亚型的形成是由控制NCAM形成的单一基因经不同的转录、转录后加工、翻译、翻译后加工形成的。NCAM结构的多样性除源于不同拼接方式外，还有糖基化、磷酸化、硫酸化等翻译后修饰的差异。对NCAM糖基化研究较多的是多聚唾液酸化。正常的胚胎期大脑发育中，NCAM翻译后需进行唾液酸化修饰在其胞外第5个Ig样区域增加PSA。 PSA-NCAM通过介导细胞间粘附以及细胞内信号传导在神经系统形态以及功能发育中起重要作用。PSA-NCAM的表达对于嗅颗粒前体细胞正常迁移至关重要。NCAM缺失的转基因小鼠和Endo-N外切酶去除PSA小鼠嗅系统发育异常导致嗅球大大减少。PSA-NCAM表达能促进海马区苔藓纤维(mfs)轴突成束和生长。NCAM缺失的老鼠海马齿状回mfs终末在CA3区的异位导致异位突触的形成。同样外切酶去除PSA的小鼠也都有mfs轴突束解除发生。PSA-NCAM参与LTP形成和维持阶段学习记忆相关蛋白的合成，在学习记忆过程中PSA-NCAM介导大量新突触联结的形成。NCAM缺失的小鼠其空间学习能力受到损害。通过颅内注射NCAM抗体干扰NCAM正常功能，大鼠海马切片的长时程增强和学习记忆均受到抑制。在海马等局部脑区域观察到在学习记忆中PSA表达的上调，用酶去除PSA可导致学习和LTP的损害。 将铅的神经毒性与PSA-NCAM在神经系统生物功能相联系，可以发现两者之间在许多方面一致性：海马是铅的作用靶器官，而在神经发育、突触形成以及LTP形成和巩固阶段，发现海马组织PSA-NCAM聚集；铅具有显著的发育神经毒性，宫内和发育早期铅暴露所造成的神经损害程度远远大于成年期铅暴露的结果。而PSA-NCAM在神经发育进程中胚胎发育后期和出生初期呈高表达，以后随着年龄增加而逐渐减少，成年阶段已处非常低的水平；铅在发育早期造成的学习记忆损害可以持续到成年，这一特征与PSA-NCAM缺陷所表现的学习记忆损害特征相同；铅通过损害LTP进而影响学习记忆的作用机制包括众多的途径，而这些途径几乎全部包括在NCAM对突触可塑性以及学习记忆所起的作用机制之中。 如上所述，我们设想假如铅损害PSA-NCAM进而通过PSA-NCAM作用而影响LTP，则现有的铅神经毒性众多途径就可能有一个贯穿其中的共同通道。我们以往研究已经从整体动物和体外培养神经元两条途径探讨了铅对NCAM表达水平和表达时程的直接影响。结果显示低水平铅在发育早期可以明显抑制和延迟海马NCAM的表达。本研究在以往研究基础上通过对体外培养的海马神经元细胞进行铅处理，进一步观察铅对NCAMmRNA表达水平影响；通过整体动物实验观察铅对NCAM多聚唾液酸化水平和时程影响。从而为全面探讨PSA-NCAM介导铅神经毒性作用机制提供依据。 具体研究内容包括：一、建立海马神经元无血清培养技术，观察低剂量铅染毒对体外培养的海马神经元生长、轴突出芽、树突延伸、神经网形成及神经元聚集等神经元发育重要环节的影响，以探讨低剂量铅在体外对神经元生长和发育的影响； 二、应用荧光定量RT-PCR技术，观察无血清原代培养技术建立的海马神经元NCAMmRNA表达的时间规律；按实验剂量加入PbCl2与细胞共培养，于不同时间分别检测神经元NCAMmRNA的表达情况，观察低剂量铅与体外培养的海马神经元NCAMmRNA表达的时间-剂量-效应关系，从体外途径探讨低剂量铅暴露对海马神经元NCAMmRNA表达产量和表达时程的影响。 三、按试验剂量给母鼠铅染毒，分别取孕14d、孕18d的胎鼠和出生后第1d、第10d的乳鼠，分离其海马组织，应用免疫组化技术检测其海马组织PSA的表达情况，从整体水平探讨宫内铅暴露对仔鼠海马组织PSA表达的影响。 研究结果如下：一、低剂量铅对原代培养的海马神经元的影响 1.实验方法SPF级孕18dWistar大鼠，无菌条件下取出仔鼠分离海马组织，分散、种植海马神经元，建立乳鼠海马神经元无血清原代培养技术，分别以10-2、10-3、10-4、10-5和10-6mmol/LPbCl2对原代培养的海马神经元进行处理，并于不同染毒时间在倒置显微镜下观察神经元生长、轴突出芽、树突延伸、神经网形成及神经细胞聚集等神经元生长情况。 2.实验结果 2.1PbCl2对神经元生长影响低于10-5mmol/LPbCl2染毒组在细胞前期生长情况与对照组没有明显区别，随时间延长至第5d，细胞突起生长减缓，联结成网开始降低，7d后聚集成团的细胞生长状况不好，可见悬浮细胞和死亡细胞碎片增多，细胞边界模糊；高于10-5mmol/LPbCl2组神经细胞贴壁减少、生长迟缓、出芽延迟、成团提前和碎片增多。 2.2PbCl2对原代培养的海马神经元突起延伸的影响培养第2d即出现10-5mmol/L及其以上剂量组神经元突起长度比对照组和10-6mmol/LPbCl2剂量组明显缩短(p＜0.05)；10-3mmol/L和10-2mmol/L剂量组至第7d出现神经元突起反而增长，是由于神经元大量死亡，存活神经元经过生存筛选导致的偏倚所致。 二、低剂量铅对原代培养海马神经元NCAMmRNA表达的影响 1.实验方法海马神经元分散、种植、染毒同前。自培养后第2d至第7d每天提取各组培养细胞的RNA，应用荧光定量RT-PCR技术来检测低剂量铅对原代培养的海马神经元NCAMmRNA表达的影响。 2.实验结果低剂量铅对原代培养的海马神经元NCAMmRNA表达的影响：培养第2d对照组与各染毒剂量组NCAMmRNA表达差别不明显；培养第3d高剂量铅染毒组(10-4、10-3、10-2mmol/L)NCAMmRNA的表达水平受到培养基中铅强烈抑制。培养第4d、第5d10-6mmol/L低剂量染毒组NCAMmRNA表达出现了降低。第6d各染毒剂量组NCAMmRNA表达均开始下降，至第7d除10-6mmol/L、10-5mmol/L维持在较高水平以外都下降到较低的水平。 三、出生前铅暴露对仔鼠海马PSA表达的影响 1.实验方法成年WistarSPF级大鼠，分对照组、0.5mmol/L、1mmol/L和2mmol/LPbCl2铅染毒组。交配前三周开始给水或饲铅染毒。分别于孕第14d、18d处死母鼠取出胎鼠分离海马和仔鼠出生后第1d、10d分离海马。应用免疫组化技术检测海马组织PSA的表达，并通过计算阳性单位(PU)定量观察发育早期铅暴露对海马组织PSA表达的影响情况。 2.实验结果 2.1PSA在海马组织中表达的时间规律：由于分离技术的限制，最早只能分离到孕第14d胎鼠的海马。研究结果显示，PSA表达的时间高峰在孕第14d及以前，自孕第14d以后，随着仔鼠年龄的增长，其PU值逐渐降低，第30d降到最低，即PSA-NCAM的表达出现随年龄增长而降低的趋势。 2.2低剂量铅暴露对大鼠海马组织PSA表达的影响：PU检测结果显示，第14d、18d铅对PSA抑制作用明显，尤其第14d铅染毒组与对照组相比表现出显著性剂量-效应关系；第21d铅抑制作用出现减弱，2mmol/L高剂量染毒组的PSA-NCAM表达甚至比0.5mmol/L、1mmol/L低剂量染毒组高；第30d0.5mmol/L、1mmol/L低剂量染毒组PSA表达反而比对照组高。通过本研究发现铅导致仔鼠海马组织PSA在NCAM上表达时程紊乱。 结论：1.极低浓度铅即可抑制体外培养的海马神经元生长、突起延伸和突触联结形成；证实发育中海马是铅神经毒性重要的作用靶器官； 2.在体外实验，发育期铅暴露抑制海马神经元NCAMmRNA表达并造成NCAMmRNA表达紊乱。 3.在整体实验，发育期铅暴露导致仔鼠海马组织PSA表达时程紊乱； 4.鉴于PSA-NCAM在海马形态及功能的正常发育和突触可塑性相关性学习记忆中的重要作用，低剂量铅暴露对PSA-NCAM表达量和表达时程上的影响可能是铅神经发育毒性非常重要的机制。