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实验目的：
肝癌是世界上主要的癌症之一，在中国也存在着大量的肝癌患者。因为肝癌患者早期症状不明显，发现的时候很多已经是中晚期，身体多处出现了肿瘤的转移，已经不适合使用手术来治疗。化疗是常见的使用方法，但是化疗的治疗过程中副作用比较大以及部分患者不耐受，使中晚期肝癌患者治疗的方法受到了极大的限制。尽管随着治疗方法的不断改进，以及免疫治疗的出现，但是肝癌患者的预后仍然不容乐观。据资料统计，肝癌患者的术后五年生存率只有10.8%，而且大部分患者死于肿瘤的转移以及肿瘤转移引起的并发症。肝癌的转移是一个复杂的过程，受到多种因素的影响。另外，有文献报道，巨噬细胞由骨髓中的单核细胞通过血液循环到达身体各个组织器官；然后在不同的微环境下分化为成熟的巨噬细胞M1型和巨噬细胞M2型。不同类型的巨噬细胞在机体的免疫中扮演着不同的角色，M1型巨噬细胞可以杀伤肿瘤并降低机体免疫，M2型巨噬细胞可以促进肿瘤的发生和转移。当肿瘤患者术后M2型巨噬细胞增多时，术后预期往往比较差。本课题组早期的研究发现，多胺与肿瘤细胞的生长和转移具有密切联系，当肿瘤患者体内多胺含量增高时，患者更容易发生肿瘤转移。因此我们猜想亚精胺是否对巨噬细胞的极化有影响？是否可以促进巨噬细胞极化为M2型并促进肿瘤的生长和转移？亚精胺如何通过巨噬细胞来影响肝癌的转移？这些问题的解决可能为肿瘤免疫治疗提供新的思路以及肝癌患者的治疗提供新的靶点。
实验方法：
体外实验
本实验利用人源THP-1细胞构建巨噬细胞M1和M2体外模型。以下三种实验方法用来验证构建巨噬细胞极化模型是否成功。
1显微镜下观察诱导后的巨噬细胞M1型和M2型的形态变化
2流式细胞仪在蛋白水平检测M1型巨噬细胞蛋白标志物CCR7和M2型巨噬细胞蛋白标志物CD206的表达水平。
3Real-timePCR在mRNA水平检测M1型巨噬细胞分子标志物iNOS，TNF-α，M2型巨噬细胞分子标志物MRC-1，CCL-18的相对表达水平。
然后体外加入亚精胺,诱导巨噬细胞加入细胞因子的时候同时加入亚精胺，并通过使用构建的巨噬细胞模型实验方法来验证亚精胺对巨噬细胞M1和M2的极化作用。然后共培养巨噬细胞和肝癌细胞，使用伤口愈合实验检测巨噬细胞M1型和M2型对肝癌细胞迁移的影响。接着通过使用Transwell使巨噬细胞和肝癌细胞共培养，外加亚精胺检测加入了亚精胺之后巨噬细胞对肝癌细胞迁移的影响。
最后进行巨噬细胞的功能型研究，利用ELISA试剂盒测M2型巨噬细胞的分泌因子IL-1β是否有变化。我们猜想IL-1β可以促进肝癌细胞的增殖，迁移和侵袭并进行其相关机制的研究。增殖方面我们使用单克隆实验和MTT实验来检测IL-1β对肝癌细胞增殖影响。迁移方面，我们从细胞行为学方面做验证，利用伤口愈合实验检测IL-1β对肝癌细胞横向迁移的影响和Transwell实验检测对肝癌细胞的纵向迁移的影响。侵袭方面，本实验使用小室铺基质胶实验来验证IL-1β对肝癌细胞侵袭的影响。机制方面，我们用蛋白免疫印迹实验探索肝癌细胞转移相关蛋白的变化。
体内实验
利用小鼠H22肝癌细胞构建小鼠肺转移模型，评价亚精胺对巨噬细胞极化的影响和巨噬细胞对肿瘤转移的影响。
实验结果：
1显微镜下观察细胞形态，M1型巨噬细胞呈长梭形，体积明显增大，M2型巨噬细胞呈不规则椭圆形，体积明显变大。
2流式细胞术实验表明，M1型巨噬细胞相关蛋白标志物CCR7明显增多，峰往右移。M2型巨噬细胞相关蛋白标志物CD206明显增多，峰往右移。
3实时荧光定量PCR检测，M1型巨噬细胞相关的iNOS，TNF-α的mRNA表达明显升高，M2型巨噬细胞相关CCL18，MRC1的mRNA表达明显升高。
4流式细胞术和实时荧光定量PCR实验表明，亚精胺抑制巨噬细胞向M1型巨噬细胞分化，促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化。
5巨噬细胞和肝癌细胞共培养，伤口愈合实验表明M1型巨噬细胞抑制肝癌细胞的迁移，M2型巨噬细胞促进肝癌的迁移。
6加入亚精胺，使用小室构建巨噬细胞，亚精胺和肝癌细胞共培养微环境，实验结果表明M1型巨噬细胞抑制肝癌细胞的迁移，M2型巨噬细胞促进肝癌细胞的迁移。
7ELISA试剂盒检测巨噬细胞分泌细胞因子IL-1β，结果表明亚精胺可以促进M2型巨噬细胞分泌细胞因子IL-1β。
8单克隆实验表明，IL-1β促进肝癌细胞的增殖
9伤口愈合实验和Transwell实验分别从横向迁移和纵向迁移两方面表明，IL-1β促进肝癌细胞的迁移。
10Transwellmatrigel实验表明，IL-1β可促进肝癌细胞的侵袭。
11蛋白免疫印迹实验结果表明，IL-1β通过AKT通路使肝癌细胞发生EMT转化，上调了p-AKT，E-cadherin蛋白，下调了N-cadherin蛋白。
12H22小鼠肝癌肺转移模型表明，亚精胺可以促进M2型巨噬细胞标志物ARG-1蛋白上调，M1型巨噬细胞的标志物iNOS蛋白下调，并因此促进肝癌细胞转移。
实验结论：
1.亚精胺可以抑制巨噬细胞向M1型极化，促进巨噬细胞向M2型极化。
2.亚精胺可以促使M2型巨噬细胞分泌的细胞因子IL-1β增多，进而促进肝癌细胞的增殖，迁移和侵袭。
3.小鼠体内实验表明，亚精胺可以促进巨噬细胞由M1型向M2型极化。
肝癌是世界上主要的癌症之一，在中国也存在着大量的肝癌患者。因为肝癌患者早期症状不明显，发现的时候很多已经是中晚期，身体多处出现了肿瘤的转移，已经不适合使用手术来治疗。化疗是常见的使用方法，但是化疗的治疗过程中副作用比较大以及部分患者不耐受，使中晚期肝癌患者治疗的方法受到了极大的限制。尽管随着治疗方法的不断改进，以及免疫治疗的出现，但是肝癌患者的预后仍然不容乐观。据资料统计，肝癌患者的术后五年生存率只有10.8%，而且大部分患者死于肿瘤的转移以及肿瘤转移引起的并发症。肝癌的转移是一个复杂的过程，受到多种因素的影响。另外，有文献报道，巨噬细胞由骨髓中的单核细胞通过血液循环到达身体各个组织器官；然后在不同的微环境下分化为成熟的巨噬细胞M1型和巨噬细胞M2型。不同类型的巨噬细胞在机体的免疫中扮演着不同的角色，M1型巨噬细胞可以杀伤肿瘤并降低机体免疫，M2型巨噬细胞可以促进肿瘤的发生和转移。当肿瘤患者术后M2型巨噬细胞增多时，术后预期往往比较差。本课题组早期的研究发现，多胺与肿瘤细胞的生长和转移具有密切联系，当肿瘤患者体内多胺含量增高时，患者更容易发生肿瘤转移。因此我们猜想亚精胺是否对巨噬细胞的极化有影响？是否可以促进巨噬细胞极化为M2型并促进肿瘤的生长和转移？亚精胺如何通过巨噬细胞来影响肝癌的转移？这些问题的解决可能为肿瘤免疫治疗提供新的思路以及肝癌患者的治疗提供新的靶点。
实验方法：
体外实验
本实验利用人源THP-1细胞构建巨噬细胞M1和M2体外模型。以下三种实验方法用来验证构建巨噬细胞极化模型是否成功。
1显微镜下观察诱导后的巨噬细胞M1型和M2型的形态变化
2流式细胞仪在蛋白水平检测M1型巨噬细胞蛋白标志物CCR7和M2型巨噬细胞蛋白标志物CD206的表达水平。
3Real-timePCR在mRNA水平检测M1型巨噬细胞分子标志物iNOS，TNF-α，M2型巨噬细胞分子标志物MRC-1，CCL-18的相对表达水平。
然后体外加入亚精胺,诱导巨噬细胞加入细胞因子的时候同时加入亚精胺，并通过使用构建的巨噬细胞模型实验方法来验证亚精胺对巨噬细胞M1和M2的极化作用。然后共培养巨噬细胞和肝癌细胞，使用伤口愈合实验检测巨噬细胞M1型和M2型对肝癌细胞迁移的影响。接着通过使用Transwell使巨噬细胞和肝癌细胞共培养，外加亚精胺检测加入了亚精胺之后巨噬细胞对肝癌细胞迁移的影响。
最后进行巨噬细胞的功能型研究，利用ELISA试剂盒测M2型巨噬细胞的分泌因子IL-1β是否有变化。我们猜想IL-1β可以促进肝癌细胞的增殖，迁移和侵袭并进行其相关机制的研究。增殖方面我们使用单克隆实验和MTT实验来检测IL-1β对肝癌细胞增殖影响。迁移方面，我们从细胞行为学方面做验证，利用伤口愈合实验检测IL-1β对肝癌细胞横向迁移的影响和Transwell实验检测对肝癌细胞的纵向迁移的影响。侵袭方面，本实验使用小室铺基质胶实验来验证IL-1β对肝癌细胞侵袭的影响。机制方面，我们用蛋白免疫印迹实验探索肝癌细胞转移相关蛋白的变化。
体内实验
利用小鼠H22肝癌细胞构建小鼠肺转移模型，评价亚精胺对巨噬细胞极化的影响和巨噬细胞对肿瘤转移的影响。
实验结果：
1显微镜下观察细胞形态，M1型巨噬细胞呈长梭形，体积明显增大，M2型巨噬细胞呈不规则椭圆形，体积明显变大。
2流式细胞术实验表明，M1型巨噬细胞相关蛋白标志物CCR7明显增多，峰往右移。M2型巨噬细胞相关蛋白标志物CD206明显增多，峰往右移。
3实时荧光定量PCR检测，M1型巨噬细胞相关的iNOS，TNF-α的mRNA表达明显升高，M2型巨噬细胞相关CCL18，MRC1的mRNA表达明显升高。
4流式细胞术和实时荧光定量PCR实验表明，亚精胺抑制巨噬细胞向M1型巨噬细胞分化，促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化。
5巨噬细胞和肝癌细胞共培养，伤口愈合实验表明M1型巨噬细胞抑制肝癌细胞的迁移，M2型巨噬细胞促进肝癌的迁移。
6加入亚精胺，使用小室构建巨噬细胞，亚精胺和肝癌细胞共培养微环境，实验结果表明M1型巨噬细胞抑制肝癌细胞的迁移，M2型巨噬细胞促进肝癌细胞的迁移。
7ELISA试剂盒检测巨噬细胞分泌细胞因子IL-1β，结果表明亚精胺可以促进M2型巨噬细胞分泌细胞因子IL-1β。
8单克隆实验表明，IL-1β促进肝癌细胞的增殖
9伤口愈合实验和Transwell实验分别从横向迁移和纵向迁移两方面表明，IL-1β促进肝癌细胞的迁移。
10Transwellmatrigel实验表明，IL-1β可促进肝癌细胞的侵袭。
11蛋白免疫印迹实验结果表明，IL-1β通过AKT通路使肝癌细胞发生EMT转化，上调了p-AKT，E-cadherin蛋白，下调了N-cadherin蛋白。
12H22小鼠肝癌肺转移模型表明，亚精胺可以促进M2型巨噬细胞标志物ARG-1蛋白上调，M1型巨噬细胞的标志物iNOS蛋白下调，并因此促进肝癌细胞转移。
实验结论：
1.亚精胺可以抑制巨噬细胞向M1型极化，促进巨噬细胞向M2型极化。
2.亚精胺可以促使M2型巨噬细胞分泌的细胞因子IL-1β增多，进而促进肝癌细胞的增殖，迁移和侵袭。
3.小鼠体内实验表明，亚精胺可以促进巨噬细胞由M1型向M2型极化。