关节软骨损伤一直是骨科面临的难题之一。关节软骨本身缺乏营养血管,再生细胞和体液因子少,软骨的细胞/基质比低,一旦关节软骨损伤,其再生能力十分有限。此外,再生软骨的生物化学和机械性能不等同于正常软骨,容易退变和侵蚀。组织工程修复软骨手段的目的是将修复物质运送到受损部位并且固定于该位置以达到有效的修复。从研究结果来看,虽然研究者们应用了多种研究方法、生物材料、种子细胞和修复方法,但修复关节软骨的长期效果并不令人满意,存在着组织工程软骨中心强度低、难以和宿主正常软骨整合、软骨和软骨下骨的断裂分层问题等难题。研究目的通过最近新兴的模拟微重力技术,将软骨组织工程中应用广泛的胶原、壳聚糖与β—TCP有机复合,模仿体内关节软骨的分层结构,构建层状梯度复合材料,并将扩增的兔扩增的经成骨诱导的兔骨髓间充质干细胞(Bone MesenchymalStem Cells,BMSCs)和关节软骨细胞植入其中体外培养,观察软骨细胞在胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体中的黏附、增殖、生长情况及生物学性状变化,以评价微重力培养方法在软骨组织工程的实用性及该复合材料作为关节软骨组织工程支架的可行性。研究方法以细胞和支架材料为实验对象,以普通培养和微重力培养分两组对照。MTT实验分组:7个时间组:1天、4天、7天、10天、13天、17天、19天;8个平行孔/组,两培养组共112孔。1.成骨细胞的诱导和软骨细胞的培养:用全骨髓贴壁筛选法培养新西兰兔原代BMSCs,体外扩增后进行成骨诱导,3周后检测细胞碱性磷酸酶活性和钙结节生成情况;取新西兰幼兔的关节软骨消化培养软骨细胞体外培养扩增,取2、3代细胞行s—100细胞免疫化学染色。2.种子细胞和材料复合:将诱导成功后的成骨细胞和前4代软骨细胞作为种子细胞与修复体复合体外普通培养和旋转培养仪模拟微重力培养,进行MTT检测比较两组细胞增殖情况并观察模拟微重力对细胞的影响;培养3w后行扫描电镜检查观察软骨细胞在修复体材料内黏附生长情况;3w后,细胞和材料复合物进行脱钙、石蜡包埋、切片,行苏木精—伊红染色、Ⅰ型胶原及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察成骨细胞和软骨细胞的生物学性状变化及模拟微重力对复合物的力学影响。统计学分析:MTT实验中,相同时间点两组之间的比较用两独立样本t检验;同组不同时间点比较采用完全随机设计单因素方差分析(One-way ANOVA);两组整体之间比较采用重复测量数据的方差分析。α=0.05为统计学检验水准。研究结果1.细胞形态:初接种时BMSCs呈球形,悬浮在培养液中,24h后开始贴壁,细胞呈长梭形,少量多角形,约1周左右细胞铺满培养瓶。加入成骨诱导培养液后细胞生长相对缓慢,其形态发生了改变,细胞逐渐增大,进而出现重叠生长。2周后细胞间可见圆形或卵圆形的钙化结节,结节周围细胞呈放射状分布。碱性磷酸酶染色阳性,Von Kossa法检测出钙化结节。体外单层培养的软骨细胞呈球形,悬浮在培养液中,5h后开始贴壁,细胞呈扁平状,大多数三角形,少量多角形,约1周细胞铺满培养瓶,呈“铺路石”样。第2、3代细胞S—100免疫细胞化学染色胞浆内呈阳性反应。2.细胞/支架光镜下观察:细胞悬液滴加于经预湿处理的复合支架材料上,支架材料迅速膨胀,证明细胞扩散到支架内。接种24h后,倒置显微镜下见材料不透明,无法观察其内细胞生长情况,但可见大量成骨细胞和软骨细胞贴附在材料旁培养板内。3.MTT检测:种子细胞和材料复合后,除第1天两组之间无显著性差异外(P=0.878),其余时间点两组之间有显著性差异(P＜0.05),模拟微重力组明显比培养板组细胞增殖力高。两组之间整体比较也有统计学意义(P=0.000),证明模拟微重力对成骨细胞在修复体内的增殖比普通培养起到了更好的促进作用。4.扫描电镜:培养3w后,普通培养组软骨细胞成团地吸附于支架表面,从切开的材料上可以观察到有部分细胞吸附于空隙内,细胞间通过突起相互连接,或伸出伪足贴附于支架孔隙壁上;模拟微重力培养组中细胞在修复体上分布更加均匀,且其中心部位软骨细胞数量明显比普通培养组多。5.HE染色和免疫学检测结果:3w后,HE染色显示培养板组的细胞多聚集在修复体表面,细胞数量明显多于修复体内部,而模拟微重力组材料表面和材料内部细胞数量相差不大,分布较均匀,修复体内部细胞数量明显比普通培养组多。两组免疫组织化学染色显示:细胞团中有基质分泌,沉积于细胞周围:含有β—TCP端Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性,不含有β—TCPⅡ型胶原免疫组织化学染色示胞浆内呈阳性反应。免疫荧光染色检测显示同一层状修复体上成骨细胞和软骨细胞同时增殖,无明显分界。结论1.成功培养出兔原代软骨细胞和BMSCs,并成功诱导BMSCs为成骨细胞,为进一步的细胞和材料的接种提供了数量充足和生物学性能良好的种子细胞。2.胶原/壳聚糖/β-TCP层状梯度复合体模拟了正常关节软骨分层结构,细胞相容性好,能提供细胞生长的三维环境。3.软骨细胞和成骨细胞联合种植在同一修复体上,体外构建骨软骨复合体,为进一步动物实验提供的基础。4.转壁式旋转培养仪产生的模拟微重力可以使成骨细胞和软骨细胞在修复体内高密度生长,能更好的促进细胞增殖和细胞外基质分泌,提高了组织工程化关节软骨体外培养的质量,为关节软骨组织工程的研究开辟了新的道路。