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研究背景: 经皮乙醇消融法是一种有效、安全、经济的小肝癌局部治疗方法.由于我国肝细胞肝癌多由肝硬化发展而来,肿瘤内存在丰富的纤维分隔,限制无水乙醇在瘤体内的弥散;而且肝癌有粗大的滋养血管,血流丰富,易冲刷无水乙醇,降低局部乙醇浓度、缩短住留时间,从而限制了无水乙醇的消融体积,指南中仅适用于直径2cm以下小肝癌.尽管如此,经皮乙醇消融对于困难部位的肝癌消融较射频或者微波消融有明显的优势,所以经皮乙醇消融依旧是肝癌治疗不可或缺的有效手段,因此在肝癌消融中获得足够大的消融体积成为经皮乙醇消融亟待解决的问题. 乙醇沸点低,注射后汽化产生乙醇气泡,可作为低强度超声的空化核,空化产生微射流、微流,在细胞膜表面、毛细血管壁形成空洞,增强组织的通透性,可能促进无水乙醇在组织和瘤体内的弥散.另外,微泡增强的超声诱导微泡剧烈空化,可使组织细胞水肿、毛细血管内皮细胞受损、血栓形成,可能造成肝脏或肿瘤的血流灌注暂时中断,减少血流对无水乙醇的冲刷.课题组前期发现,微泡增强的超声联合经皮乙醇消融可增加兔肝脏消融体积 10 倍以上,或将大鼠 Walker-256肿瘤的消融坏死率从81.0%提高至97.5%. 研究目的: 本研究设想将低强度超声激励乙醇气泡空化增强乙醇弥散、微泡增强的超声阻断血流灌注减少乙醇冲刷这两种方法应用于无水乙醇消融,研究该方法消融兔肝脏和大鼠Walker-256肿瘤的有效性、安全性. 材料与方法: 1. 主要实验仪器 (1)CZ-960 型脉冲式超声空化治疗仪(绵阳索尼克电子有限责任公司),其弱聚焦式圆形换能器中心频率 831kHz,峰值负压 4.3MPa.采用两组超声参数分别用于激励酒精微泡空化和脂质微泡空化. (2)飞依诺VINNO70彩色多普勒超声诊断仪(飞依诺科技(苏州)有限公司), X4-12L高频线阵探头,频率4-12MHz.超声造影选择CBI模式,机械指数约0.11. 2. 主要实验试剂 微泡:陆军军医大学第二附属医院超声科自制脂质微泡,核心气体为全氟丙烷,磷脂包被,平均粒径2μm,浓度约(4-10)×109/ml.在本实验中主要作为超声造影剂及微泡增强的超声的空化核. 3. 实验动物 (1)健康新西兰大白兔 62 只,雌雄不限,体重约 2.5kg,用于超声空化增强无水乙醇消融兔肝脏的有效性及安全性实验. (2)健康雄性SD大鼠28只,体重约200g,建立单侧腿部皮下Walker-256肿瘤模型,用于超声空化增强无水乙醇消融大鼠Walker-256肿瘤实验. 4. 实验方法 (1)超声空化增强无水乙醇消融兔肝脏的有效性及安全性实验研究 ① 实验分组及处理:健康新西兰大白兔62只随机分为5组,分别是单纯低强度超声激励组(LIUS,n=6),单纯无水乙醇消融组(EA,n=14),低强度超声激励联合无水乙醇消融组( LIUS+EA , n=14 ) ,微泡增强的超声联合无水乙醇消融组( MEUS+EA , n=14 ) ,微泡增强的超声联合低强度超声激励增强无水乙醇消融组(MEUS+LIUS+EA,n=14).LIUS组肝左叶给予占空比0.036%超声辐照6分钟,EA组肝左叶注射 0.5ml 无水乙醇, LIUS+EA 组于无水乙醇注射同时给予超声辐照, MEUS+EA及MEUS+LIUS+EA组经MEUS处理后,分别在超声造影显示的灌注减少区注射乙醇或在0.036%占空比超声辐照同时注射乙醇. ② 超声造影及定量分析:LIUS、MEUS+EA及MEUS+LIUS+EA组分别于超声辐照处理后即刻,对肝左叶、肝中叶进行超声造影并进行动态影像数据处理,获得处理叶(左叶)和对照叶(中叶)的造影数值,分析LIUS、MEUS对兔肝脏血流灌注的影响. ③ 肝功能检测:除LIUS组外,其余组各取3只实验兔于处理前、处理后即刻、48h、5d及7d抽取动脉血检测ALT、AST含量. ④ 消融体积测量:处理后48 h获取各组肝脏组织,利用量筒排液法测量肝脏无水乙醇消融体积. ⑤ 组织病理学检测:处理后 48 h 获取各组肝脏组织,固定、包埋、切片、HE染色,光镜观察处理区域组织学改变. (2)超声空化增强无水乙醇消融大鼠Walker-256皮下肿瘤的实验研究 ① 大鼠Walker-256皮下肿瘤模型建立:Walker-256细胞常规培养,待细胞浓度为(1-5)×107/ml时,接种大鼠右后肢内侧皮下0.2ml细胞悬液建立Walker-256皮下肿瘤模型. ② 实验分组及处理:28只Walker-256荷瘤大鼠随机分为4组,分别是单纯无水乙醇消融组(PEA,n=7),低强度超声激励联合无水乙醇消融组(LIUS+PEA,n=7),微泡增强的超声联合无水乙醇消融组(MEUS+PEA,n=7),微泡增强的超声联合低强度超声激励增强无水乙醇消融组(MEUS+LIUS+PEA,n=7).PEA 组于瘤体中心注射无水乙醇0.2 ml,LIUS+PEA组在0.036%占空比超声辐照同时注射无水乙醇0.2 ml,MEUS+PEA 及 MEUS+LIUS+PEA 组经 MEUS 处理后,分别注射无水乙醇或在0.036%占空比超声辐照同时注射无水乙醇. ③ 超声造影及定量分析:MEUS+PEA组及MEUS+LIUS+PEA组于MEUS处理前后进行超声造影,根据肿瘤区域时间强度曲线,获得MEUS处理前后的PI及AUC值,分析MEUS对肿瘤组织血流灌注的影响. ④ 肿瘤坏死率及组织病理学检测:处理后24h获取各组肿瘤组织,固定、包埋、切片、HE染色,Image-Pro Plus 6.0软件勾画坏死区面积获得坏死率,光镜观察肿瘤组织学改变. 结果： 1.超声空化增强无水乙醇消融兔肝脏的有效性及安全性实验研究: (1) LIUS 组处理肝叶与对照肝叶峰值强度、曲线下面积差异均无统计学意义(P>0.05);MEUS+PEA及MEUS+LIUS+EA组处理肝叶峰值强度、曲线下面积值均显著低于对照肝叶(P<0.01). (2) EA、LIUS+EA、MEUS+EA、MEUS+LIUS+EA组于处理后出现ALT及AST测值轻微升高, 48h 到达高峰, 7d 恢复至治疗前水平,但各组间比较无显著差异(P>0.05). (2) EA、LIUS+EA、MEUS+EA、MEUS+LIUS+EA组于处理后出现ALT及AST测值轻微升高, 48h 到达高峰, 7d 恢复至治疗前水平,但各组间比较无显著差异(P>0.05). (3) LIUS 组兔肝脏靶区未见明显坏死灶;EA 组肝脏完全消融体积平均值为(0.84±0.27)ml,LIUS+EA 组为(2.42±1.11)ml,MEUS+EA 组为(3.52±1.34) ml,MEUS+LIUS+EA组为(4.01±1.45)ml;LIUS+EA、MEUS+EA及MEUS+LIUS+EA组消融体积均显著高于EA组(P<0.01),但该三组间无统计学差异(P>0.05). (4) LIUS组未见明显病理改变,其余四组均出现广泛肝细胞凝固性坏死. 2. 超声空化增强无水乙醇消融大鼠Walker-256皮下肿瘤的实验研究: (1) MEUS+PEA及MEUS+LIUS+PEA组MEUS处理后峰值强度、曲线下面积较治疗前显著降低(P<0.01). (2)各组均存在不同范围的肿瘤存活区和消融坏死区.PEA组Walker-256肿瘤消融坏死率平均值为(70.24±5.79)%,LIUS+PEA组为(79.72±3.29)%,MEUS+PEA组为( 85.92 ± 3.66 )%, MEUS+LIUS+PEA 组为( 85.69 ± 6.74 )%;LIUS+PEA、MEUS+PEA 及 MEUS+LIUS+PEA 组肿瘤坏死率均显著高于 PEA 组(P<0.01),且MEUS+PEA及MEUS+LIUS+PEA组肿瘤坏死率高于LIUS+PEA组(P<0.05),但是MEUS+PEA与MEUS+LIUS+PEA组肿瘤坏死率差异无统计学意义(P>0.05). 结论： 1.低强度超声及微泡增强的超声均可显著增加无水乙醇消融兔肝脏体积,且不会导致肝功能损伤加重. 2.低强度超声及微泡增强的超声均可显著增加无水乙醇消融 SD 大鼠 Walker-256肿瘤坏死率.