背景：诱导分化治疗是肿瘤化学治疗的一个重要领域,它利用分化诱导剂诱导肿瘤细胞分化成为正常或接近正常的细胞,从而逆转其增殖、浸润、转移等恶性表型来达到治疗肿瘤的目的。维甲酸类化合物是被研究和临床应用最为广泛的分化诱导剂,其中全反式维甲酸(all-trans retinoid acid, ATRA)是第一个成功应用于白血病治疗的诱导分化药物,能够特异性诱导急性早幼粒细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)细胞分化成熟,完全缓解率高达90%,而且不诱发弥漫性血管内出血(disseminated intravascular coagulation, DIC),不引起骨髓抑制。ATRA的作用特点有别于传统的细胞毒类抗肿瘤药物,其作用机理的研究一直受到国内外专家的广泛关注,并取得了重要成就。但是目前仍未有系统的理论解释ATRA诱导细胞分化的分子机制,这也很大程度地限制了ATRA在临床的广泛应用。因此进一步研究维甲酸类药物诱导细胞分化的分子机制,具有重要的理论意义和应用前景,是目前细胞分子生物学领域的热点之一泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway, UPP)是细胞内大部分蛋白质选择性降解的重要途径,因此泛素-蛋白酶体通路广泛参与如细胞周期调控、细胞凋亡、DNA修复、细胞信号转导、蛋白的跨膜定位和细胞表面膜受体的内化等多种生理过程,对细胞的增殖及恶变有重要影响。近年来,泛素-蛋白酶体通路与细胞分化之间的相关性正受到国内外专家学者日益广泛的关注。泛素-蛋白酶体通路在晶状体上皮细胞、神经元细胞和少突神经胶质细胞等的分化过程中发挥了重要的作用,但具体的作用机制又各有不同。2000年我国科学家研究发现,泛素-蛋白酶体通路相关的基因在ATRA处理的APL细胞内表达明显增加。此外,介导ATRA信号转导的维甲酸受体RARa及其融合蛋白PML-RARa在ATRA作用过程中均由于泛素-蛋白酶体通路的降解而减少。由此可见,泛素-蛋白酶体通路在ATRA诱导白血病细胞分化过程中具有重要而复杂的作用。但是,泛素-蛋白酶体通路与ATRA诱导白血病细胞分化的相关性研究至今未见报道。因此,本研究将系统探讨泛素-蛋白酶体通路在ATRA诱导白血病细胞分化中的作用,研究蛋白酶体抑制剂对ATRA诱导白血病细胞分化的影响。具体研究内容分为三个部分：1)阐明ATRA诱导白血病细胞分化过程中,泛素-蛋白酶体通路活性变化,进而分析抑制蛋白酶体活性对ATRA诱导细胞分化的影响。2)采用多种蛋白酶体抑制剂与ATRA联合作用,从细胞水平和整体动物水平系统评价两药联合作用对白血病细胞分化的影响,并探讨可能的分子作用机制。3)在细胞水平研究ATRA与蛋白酶体抑制剂联合作用诱导白血病细胞凋亡的作用及机制,以期为两药在临床上合理应用提供理论依据。第一章全反式维甲酸对人急性髓性白血病细胞泛素-蛋白酶体通路活性的影响目的：ATRA作为肿瘤诱导分化治疗的成功范例,其复杂的作用机制一直是细胞分化领域的研究热点之一。本课题通过研究ATRA诱导白血病细胞分化过程中泛素-蛋白酶体通路活性变化,进而分析抑制蛋白酶体活性对ATRA诱导细胞分化的影响,力求系统阐明泛素-蛋白酶体通路在ATRA诱导白血病细胞分化过程中的重要作用。方法与结果：ATRA作用后,人急性髓性白血病细胞HL60和NB4细胞内泛素化蛋白表达水平均呈时间依赖性的变化趋势。采用特异性蛋白酶体底物Suc-LLVY-AMC检测ATRA作用后细胞内蛋白酶体水解活性变化,结果表明ATRA能够明显增强蛋白酶体的水解活性,且呈时间依赖性关系,说明细胞内泛素化蛋白水平的增加是ATRA作用的直接结果,而非蛋白酶体活性降低导致的。荧光定量PCR结果表明,ATRA作用后泛素mRNA水平也呈时间依赖性递增趋势,其原因可能是为了满足靶蛋白的泛素化标记需求。上述泛素-蛋白酶体通路各组成成分的活性变化与ATRA诱导的细胞分化进程具有高度的一致性,提示泛素-蛋白酶体通路可能参与调节ATRA诱导的白血病细胞分化过程。于是我们采用蛋白酶体抑制剂MG132来研究泛素-蛋白酶体通路与ATRA诱导的白血病细胞分化的确切关系。结果发现,抑制ATRA对蛋白酶体的活化作用能明显增强ATRA的诱导分化能力,说明增高的蛋白酶体活性并不利于ATRA诱导白血病细胞分化。进一步研究发现,抑制ATRA对蛋白酶体的激活作用可以阻止维甲酸受体RARa及其融合蛋白PML-RARa的泛素化降解使其得到累积,从而增强ATRA诱导的白血病细胞分化作用。此外,采用基因转染技术使细胞高表达维甲酸受体RARa,观察白血病细胞内RARa蛋白表达水平与细胞对ATRA的敏感程度相关性。结果表明,细胞内RARa蛋白含量的增多不仅能显著降低ATRA作用浓度,还能加速分化进程,该结果证实细胞内RARa表达水平决定了白血病细胞对ATRA的敏感程度。结论：全反式维甲酸在诱导白血病细胞分化过程中能激活泛素-蛋白酶体通路,而显著增强的蛋白酶体活性可能对ATRA诱导的细胞分化产生不利的影响,因为抑制ATRA对蛋白酶体的活化作用能明显促进ATRA对白血病细胞的诱导分化作用,其作用机制可能与抑制维甲酸受体RARa蛋白的泛素化降解密切相关。第二章蛋白酶体抑制剂联合全反式维甲酸诱导人急性髓性白血病细胞分化的药效学评价及机制研究目的：基于第一部分的研究结果,本研究将在细胞水平和动物水平进一步确认蛋白酶体抑制剂与ATRA联合作用对人急性髓性白血病的诱导分化治疗作用,并探讨可能的分子作用机制,以期为临床上ATRA联合用药方案提供新的策略。方法与结果：我们通过细胞计数、NBT还原试验、瑞氏-吉姆萨染色和流式细胞术检测细胞表面分化抗原CDllb表达等方法,在细胞水平证实蛋白酶体抑制剂PS341、Lactacystin和LLnL能显著促进ATRA对人急性髓性白血病细胞HL60的诱导分化作用。采用人白血病HL60细胞裸小鼠移植瘤模型在动物水平证实PS341与ATRA联合作用对白血病的诱导分化治疗作用,两药联合能显著抑制移植瘤的生长,具有良好的协同作用。采用Western blot检测PS341与ATRA联合作用后HL60细胞内及裸小鼠移植瘤组织中RARa蛋白表达水平,结果表明PS341能抑制RARa蛋白的泛素化降解使其累积,进而促进白血病细胞分化。荧光定量PCR结果表明,蛋白酶体抑制剂与ATRA联合作用后能促进RARa直接作用的靶基因STAT1和PU.1的基因转录,提示累积的RARa蛋白仍然具有生物学功能,与ATRA结合后能启动下游基因的转录。蛋白酶体抑制剂还通过促进C/EBPa和C/EBPε这两个与髓性细胞分化密切相关的核转录因子的表达,从而增强ATRA对白血病细胞的诱导分化作用。此外,蛋白酶体抑制剂与ATRA联合作用能进一步抑制c-Myc蛋白表达,进而影响c-Myc下游相关蛋白Cyclin E、p27等蛋白水平,从而增强ATRA对白血病细胞G0/G1期阻滞作用。结论：本实验在体内外水平证明蛋白酶体抑制剂能够明显促进ATRA对人急性髓性白血病的诱导分化治疗作用,具有良好的协同效果。其作用机制可能是通过抑制维甲酸受体RARa的泛素化降解使其得到累积,进而促进下游与分化相关基因(STAT1和PU.1)的转录,从而促进细胞分化。蛋白酶体抑制剂还通过调节C/EBPa、C/EBPε、c-Myc、CyclinE、p21和p27等蛋白表达进而增强ATRA对白血病细胞的诱导分化作用。第三章蛋白酶体抑制剂联合全反式维甲酸诱导人急性髓性白血病细胞凋亡作用及相关机制研究目的：目前,ATRA结合化疗的治疗手段已成为急性髓性白血病治疗领域研究的热点问题。作为第一个成功应用于临床蛋白酶体抑制,PS341表现出了显著的抗肿瘤治疗作用。我们在前两部分研究中观察到,在适当的浓度下(对白血病细胞几乎没有杀伤作用),蛋白酶体抑制剂能够明显促进ATRA对人急性髓性白血病细胞的诱导分化作用。因此我们希望观察蛋白酶体抑制剂与ATRA联合用药对人急性髓性白血病细胞的诱导凋亡作用,进而全面掌握PS341与ATRA联合应用的作用效果与药物浓度之间的相关性,同时观察给药顺序对两药联合作用药效的影响。方法与结果：我们采用同时给药和序贯给药两种方式观察ATRA与蛋白酶体抑制剂联合作用对人急性髓细白血病细胞的诱导凋亡作用。结果发现,同时给药方案ATRA与PS341具有协同诱导白血病细胞凋亡的作用；而序贯给药方式,ATRA预先作用后PS341对白血病细胞的诱导凋亡作用明显受到抑制。通过比较PS341对正常的和经ATRA预处理的NB4和HL60细胞蛋白酶体活性抑制情况,我们发现PS341均能显著抑制细胞内蛋白酶体活性,说明ATRA对蛋白酶体活性的激活作用并不参与调节ATRA诱导的白血病细胞对蛋白酶体抑制剂的耐受作用。通过Western blot检测Bcl-2家族蛋白Bcl-2、Bax和Mcl-1的蛋白水平变化。我们观察到PS341作用后,Mcl-1蛋白呈时间依赖性递增趋势,提示Mcl-1蛋白并不参与调节PS341诱导的细胞凋亡过程；而ATRA作用后细胞内Bcl-2/Bax(?)率显著减少,但此时白血病细胞并没有明显的凋亡,说明这些蛋白并不是ATRA引起白血病细胞对PS341耐药的影响因素。随后,我们观察到ATRA作用后细胞内p-MEK、c-FLIP和Procaspase-8蛋白水平较对照组明显增高。采用PD98059抑制MEK的磷酸化,经ATRA预处理的白血病细胞对PS341的耐受作用明显减弱,此时ATRA对c-FLIP和Procaspase-8蛋白表达的促进作用也受到抑制,说明ATRA通过磷酸化激活MEK蛋白,进而促进c-FLIP和Procaspase-8蛋白表达,从而抑制caspase-8引起的caspase级联反应来抑制PS341对白血病细胞的诱导凋亡作用。结论：本研究从细胞水平证明,PS341与ATRA同时给药的联合作用方案能明显促进PS341的诱导凋亡作用；而ATRA预先作用再给予PS341的序贯给药方式反而对PS341的抗肿瘤效果具有抑制作用,其作用机制可能与ATRA激活MEK蛋白的磷酸化,进而促进FLIP蛋白表达,从而抑制死亡受体通路相关。我们的研究结果提示,如果希望通过发挥蛋白酶体抑制剂的诱导凋亡作用而将其与ATRA进行联合作用时,两药的给药顺序需要慎重考虑。