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蛋白质翻译后修饰是真核生物基因转录翻译后行使生物学功能的重要一环,如泛素化、磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化和SUMO化等,这种翻译后修饰可以使细胞快速便捷地调控蛋白质的功能,灵敏地应对内外环境的变化。SUMO(small ubiquitin-like modifier)是近年来发现的在结构上类似于泛素的一类小分子蛋白质修饰物,SUMO化修饰具有广泛的功能,主要体现在被其修饰的底物上。目前的研究表明,植物的SUMO化修饰在植物生长发育、激素信号转导、抗病防御以及应对非生物胁迫等方面起重要作用。
SUMO化修饰的结果是在修饰蛋白C端的Gly残基和底物蛋白Lys的ε氨基之间形成一个异肽键。其具体过程也与泛素化修饰十分相似,涉及多个酶的级联反应:E1活化酶,E2结合酶以及E3连接酶,但二者反应途径中涉及到的酶完全不同。
本实验首先利用大肠杆菌表达系统成功将编码拟南芥SUMO化过程中的SUMO、E2结合酶及E3连接酶AtMMS21基因克隆到表达载体上,通过IPTG诱导分别使拟南芥SUMO、E2结合酶及E3连接酶AtMMS21蛋白得到了有效表达。结果表明:
(1)采用0.1mM IPTG浓度、18℃诱导10小时为最佳表达条件。SDS-PAGE电泳分析其可溶性,结果表明在此条件下表达的融合蛋白可溶。选择上清经过过谷胱甘肽-琼脂糖树脂或NI-NTA亲和柱,再经超滤管进行超滤,得到了纯化的拟南芥SUMO、E2结合酶及E3连接酶AtMMS21蛋白。
(2)将纯化得到的拟南芥SUMO、E2结合酶、E3连接酶.AtMMS21蛋白和在大肠杆菌中表达的酵母SUMO E1活化酶(AOS、UBA2)构建成体外SUMO化检测系统,利用该系统发现了AtMMS21的自身SUMO化,说明AtMMS21是一个编码拟南芥SUMOE3连接酶的基因。