体细胞能通过细胞融合、核移植和诱导多能干细胞(iPSCs)技术等方法进行重编程,其中诱导多能干细胞技术是近些年发展起来的一种新方法,即采用特异性转录因子,将体细胞重编程成具有干细胞特性的诱导多能性干细胞。然而,该方法通常需要借助病毒载体将外源基因整合到宿主细胞基因组,获得的多能干细胞看起来似乎正常,但有可能存在外源基因过表达等安全隐患,进而限制其在基础研究和临床上的应用,因此,人们一直致力于寻找导入外源基因的安全方法,并尽可能控制外源转录因子使用与表达。前人的研究发现利用小分子化合物可获得完全化学诱导小鼠多能干细胞(CiPSCs),该方法可以避免病毒及转录因子给细胞带来的应用以及安全问题,这开启了细胞重编程的新方向。但目前这一小分子化合物诱导体系存有两个明显不足,重编程时间相对较长(30-40天)以及血清的使用可能影响重编程机制的探讨。为了解决这两个问题,本研究利用无血清基础液添加相关小分子化合物,将胎鼠成纤维细胞(MEF)重编程为化学诱导多能干细胞(mCiPSCs),并对其细胞生物学特性进行鉴定,通过调整和优化小分子化合物组合和浓度,观察对重编程时间的影响,以建立和优化小分子化合物诱导体系,为进一步探讨重编程机理奠定基础。1、建立了小分子化合物诱导小鼠CiPSCs体系。在基础液N2827中,添加7个小分子化合物CHIR98014、Forskolin、616452、DZNep、VPA、 Tranylcypromine、TTNPB,诱导MEF重编程。结果发现,诱导2天后,细胞形态开始发生变化,8天后形成克隆。mCiPSCs克隆形态与胚胎干细胞类似,呈现凸起的3D状态,边缘整齐、折光性强、与周围细胞界限明显,细胞排列紧密、核质比增加。目前已获得4株mCiPSCs细胞系,均可传至10代以上并保持原有克隆形态。2、初步鉴定了小鼠CiPSCs的生物学特性。结果显示,小鼠CiPSCs细胞有强的碱性磷酸酶活性(AP)；免疫组化结果显示,表达OCT4、SOX2、E-cadherin和SSEA-1,未检测到NANOG表达；RT-PCR结果表明,该细胞表达OCT4、SOX2、KLF4、CDH1、DNMT3B、DAPP4和REX1等；同时,该克隆在体外可自发分化成三个胚层的细胞,免疫荧光检测到分化的细胞表达SMA(Mesoderm中),beta-tutulin (ectoderm外),SOX 17 (Endoerm内)三个胚层的标志蛋白,同时RT-PCR结果也表明这些分化细胞表达三个胚层的标志基因,分别为Endoderm:FOXA2、HNF4A;ectoderm:NES、 TUBB3; Mesoderm:MEF2、BMP4、VIM,表明这些获得小鼠CiPSCs样细胞具有体外分化能力。对Nanog基因启动子区甲基化程度检测结果表明,随小鼠CiPSCs细胞代数增加,Naong启动子区甲基化程度逐渐降低。3、优化了小分子化合物诱导小鼠CiPSCs体系。探讨了不同浓度CHIR98014处理对诱导mCiPSCs原代克隆形成的影响,在诱导前8天于诱导液中添加不同浓度CHIR98014,待克隆形成后统计直径50-120um克隆数,结果发现,2.5uM CHIR98014浓度更有利于小鼠CiPSCs样细胞重编程,重编程效率比10或20uM浓度提高3-5倍。筛选了可替代7i诱导液的传代培养基,在解冻复苏mCiPSCs时,使用4i/LIF(CHIR9801、Forskolin、616452、PD0325901)培养液,结果显示,与7i液相比,用4i/LIF培养液,更适合解冻复苏小鼠CiPSCs样细胞传代后细胞的增殖。以上结果表明,在本实验室条件下,己初步建立无血清、化学成分明确的小分子化合物诱导mCiPSCs体系,且其重编程时间缩短至8天,获得的mCiPSCs细胞具有一定的多能性。