背景与目的类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)约影响全世界1%的人口,是一种常见的慢性自身免疫性疾病且女性患者人数约为男性的2-3倍。该病的详细发病因素目前还不是非常清楚,研究表明可能与基因和激素分泌水平有关。非甾体抗炎药和糖皮质激素,慢作用抗风湿药和生物制剂以及中药有效成分和复方是目前常用的抗RA的药物。近年来,研究者发现中药的许多有效成分如苷类,生物碱及黄酮类等具有很好的抗炎镇痛和免疫调节的作用。中药复方在抗RA的作用上疗效显著并且具备毒性低,价格低等优于临床常用化学药物的特点。白仙风汤剂是一味临床用于RA的经验方剂,主要由白芍,炙甘草,青风藤,威灵仙组成,根据其他症状辅以其他药物进行治疗,临床疗效显著。但由于中药复方成分复杂,其确切的治疗机制目前在研究上仍然十分困难,因此限制了中药复方在临床治疗上的使用。基于“疾病,基因,靶点,药物”的相互作用理念的网络药理学是整合计算机与系统生物学的基础上开展的新型研究技术,经网络构建和特征的剖析,发现药物与疾病、通路间的相互关联,揭秘药物治疗疾病的奥秘。本研究通过使用该技术分析传统方剂“白仙风汤剂”治疗RA的机制,并通过设计动物实验进行了机制的验证,试图解释该中药复方缓解RA的可能涉及的机制通路,从而为其临床运用提供药理根据。材料与方法1网络药理学研究1.1采用网络药理学的研究办法对白仙风汤剂组方中的白芍,炙甘草,青风藤和威灵仙四味草药的有效活性成分进行数据库的检索,进一步对这些有效活性成分的靶点进行检索,为运用Cytoscape3.2.1软件构建白仙风汤剂药物-靶点网络做数据准备。1.2使用公共的疾病相关数据库对RA的相关靶点进行检索,导入Cytoscape3.2.1软件进行分类和可视化之前使用STRING数据库对这些检索到的靶点蛋白进行相互关系(protein-protein interaction,PPI)构建并导出数据关系做预处理准备。1.3将药物相关靶点与疾病相关靶点网络进行映射发现药物作用于疾病的靶点,对这些靶点的重要程度进行拓扑数据的分析并筛选药物作用于RA的核心靶点。使用DAVID数据平台进行生物过程的KEGG通路分析和GO分析发现药物作用于RA最可能的通路并进行下一步的实验验证。2动物实验研究2.1建立经典的佐剂关节炎(Adjuvant arthritis,AA)大鼠模型并进行正常,模型和甲氨蝶呤组,以及白仙风汤剂低、中、高剂量组分组治疗,在治疗结束时进行采血及样本采集。2.2在大鼠处死之前对大鼠踝关节和膝关节进行影像学检测,评估模型构建情况和各组治疗效果。2.3采用ELISA法测定各组血清样本中IL-1β和TNF-α表达水平并对模型构建情况和各组治疗效果进行评估。2.4采用HE染色法对大鼠踝关节和脾脏进行切片染色,对模型构建情况和各组治疗效果进行评估。2.5采用PCR法对大鼠脾脏组织中IL-6,TNF-α和IFN-γm RNA表达水平进行测定并评估模型构建情况和各处理组的治疗效果。2.6 Western blot实验对大鼠膝关节软骨组织中CollagenⅡ,PI3K和p-PI3K,Akt和p-Akt,IKKα,P65和p-P65,Cleaved-caspase8和Cleaved-caspase3以及MMP9,TNF-α,IL-1β,IL-6蛋白表达水平进行测定,验证白仙风汤剂是否通过TNF-PI3K-Akt-NF-κB信号通路影响RA的进展。3统计学方法:3.1网络药理学研究部分采用Fisher确切验证法在p<0.05时认定该条目具有显著意义。在通路验证部分,DAVID数据平台采用经Bonferroni和Benjamini’s校正后的Fisher确切验证法在p<0.05时认定该条目具有显著意义。3.2在后续验证试验的数据处置中采用SPSS19.0进行数据分析,计量资料用均数±标准差并在方差齐性前提验证下运用单因素方差分析(ANOVA)或非配对t检验比较组间差别在p<0.05时认定结果具有统计学意义。结果1网络药理学结果1.1白芍、炙甘草、青风藤、威灵仙四味草药的有效活性成分从TCMSP数据库检索并去除共有的成分及无靶点的成分共获得81个有效活性成分和569个靶点。1.2从Dis Ge NET,OMIM,Pharm Gkb三个疾病数据库共检索到569个RA相关靶点。与药物靶点映射后得到药物作用于RA的56个靶点的网络。对网络进行拓扑分析,筛选得到7个大于平均degree值的核心靶点,对药物作用于RA的全部靶点和核心靶点分别进行富集分析,分别发现83条和6条p<0.05的显著性通路并且在综合分析这些通路中TNF signaling pathway的p值最小,将其作为后续的验证通路。2动物实验验证结果2.1影像学结果显示,模型组大鼠与正常组大鼠比较踝关节骨质增生变化,骨关节表面欠光滑,关节间隙变窄并出现组织炎性肿胀。给予阳性药甲氨蝶呤治疗后关节变形改善,组织炎症肿胀缓解。白仙风汤剂中高剂量治疗能明显缓解AA大鼠踝关节病理症状。2.2踝关节病理切片HE染色显示白仙风汤剂可以浓度依赖性缓解AA大鼠软骨表面的侵蚀和滑膜的浸润。2.3血清ELISA检测结果显示白仙风汤剂可以浓度依赖性降低AA大鼠血清中TNF-α和IL-1β的表达。2.4实时定量PCR实验结果表明白仙风汤剂可以浓度依赖性降低AA大鼠脾脏中IL-6和TNF-α基因的表达,同时浓度依赖性升高AA大鼠脾脏中IFN-γ基因的表达。2.5 Western blot实验结果表明白仙风汤剂可以浓度依赖性升高AA大鼠软骨组织中降解的collagenⅡ的表达的同时抑制p-PI3K,p-Akt和p-P65的水平,抑制IKKα及凋亡蛋白cleaved-caspase8和cleaved-caspase3、外周炎症基质IL-6和IL-1β、MMP9及TNF-α蛋白的表达。结论1网络药理学预测结果通过使用网络药理学的方法成功发现了白仙风汤剂复方中81个有效活性成分,56个治疗RA的相关靶点和7个核心靶点,并预测到83条可能影响的通路以及6条核心的通路,其中TNF signaling pathway是我们综合参考值主要考虑研究的通路。2动物实验结果动物实验成功构建了AA大鼠模型并在实验验证的结果中显示白仙风汤剂以浓度依赖性影响TNF-PI3K-Akt-NF-κB信号通路过程中的特征蛋白表达,表现为p-PI3K,p-Akt及p-P65激活的减少,降低软骨组织中cleaved-caspase8和cleaved-caspase3等凋亡蛋白的表达,降低外周炎性基质MMP9,TNF-α,IL-6和IL-1β的蛋白水平并缓解AA大鼠的关节炎症状,不仅辅证了网络药理学的预测结果而且为白仙风汤剂的临床使用提供了药理学根据。