【摘 要】
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乙酸乙酯是一种具有水果香味的酯类物质,可赋予白酒、果酒、花酒等丰富的香味,对于酒体风味形成具有重要的意义。目前,大量低度发酵酒中尚存香气组分少、香味不足等缺陷。本课题以醇乙酰基转移酶代谢途径中的EAT（编码醇乙酰基转移酶基因）为研究对象,利用基因工程的方法在酿酒酵母中克隆表达异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）FBKL2.00K8中的EAT,探究目的基因的过量表达对
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乙酸乙酯是一种具有水果香味的酯类物质,可赋予白酒、果酒、花酒等丰富的香味,对于酒体风味形成具有重要的意义。目前,大量低度发酵酒中尚存香气组分少、香味不足等缺陷。本课题以醇乙酰基转移酶代谢途径中的EAT（编码醇乙酰基转移酶基因）为研究对象,利用基因工程的方法在酿酒酵母中克隆表达异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）FBKL2.00K8中的EAT,探究目的基因的过量表达对酿酒酵母乙酸乙酯生成量的影响,以及对低度发酵酒性能和香味的评价。主要研究成果如下:1.利用PCR方法从异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）FBKL2.00K8中扩增得到目的基因EAT,连接至p MD 19-T载体后测序,得到正确序列。对目的基因进行生物信息学分析发现:目的蛋白与异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）NRRL Y-366-8中的此类蛋白具有高达99%的相似度,由490个氨基酸编码组成,蛋白分子量为53.9 KDa,理论等电点（p I）为6.8,消光系数（λ=280nm）是66740 M-1cm-1。该蛋白属于疏水性蛋白,其二级结构主要以α-螺旋、β-转角和无规则卷曲三种形式存在,分别占氨基酸总数的40%、2.86%和40.41%,无跨膜结构,属于分泌蛋白;利用闪电克隆技术将目的基因EAT连接至穿梭载体Yep-PGK,构建重组质粒Yep-PEK,并利用酵母醋酸锂转化法将重组质粒导入到酿酒酵母W303-1A的感受态细胞中,成功构建一株表达目的蛋白的工程菌W303-EAT。2.以醇乙酰基转移酶代谢途径为依据,通过监测不同发酵时期乙酰辅酶A、丙酮酸及乙酸乙酯的含量变化,分析代谢物变化情况,证明了目的基因EAT在工程菌W303-EAT中可有效催化乙酰辅酶A和乙醇生成乙酸乙酯,对于乙酸乙酯的生成量有重要影响;对工程菌W303-EAT的酶学性质进行研究发现,与原始菌W303-1A相比,工程菌W303-EAT的醇乙酰基转移酶酶活力显著提高约5-6倍。重组酶的最适反应温度为30°C,低于30°C范围内酶活较稳定。重组酶的最适p H为7,在p H为7-8范围内酶分子较稳定。金属离子Mg2+、K+、Ca2+能够提高该酶活性,Fe3+、Mn2+对酶活的影响不大,Zn2+、Cu2+、Hg2+、Ag+、Cd2+、Ba2+及Pb2+等均会使酶活性降低。3.对工程菌W303-EAT进行发酵性能测试,结果显示:与原始菌W303-1A相比,工程菌W303-EAT的CO2损失量、酒精度、还原糖含量等均无显著差异（P>0.05）,工程菌W303-EAT产乙酸酯类物质的能力明显提高,其中乙酸乙酯的含量提高了6.14倍,乙酸苯乙酯的生成量提高了1.5倍。高级醇（异丁醇、异戊醇）的含量均有所下降;将工程菌W303-EAT应用于低度发酵酒（米酒、蓝莓酒、柚子酒和玫瑰花酒）,探究其与原始菌和市售干酵母产香特性的差异。结果表明,工程菌W303-EAT产乙酸乙酯能力略高于市售酵母,较原始菌W303-1A有明显提高,分别提高4.28倍、0.18倍、0.24倍和1.57倍,尤其在米酒和玫瑰花酒中具有很好的提酯增香效果。工程菌W303-EAT发酵酒中的高级醇含量最低,具有一定的降高级醇作用。
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