论文部分内容阅读
电压门控型钠离子通道(VGSC)主要表达于中枢神经系统(CNS)中，参与动作电位产生过程，并且是众多局麻药、镇痛及抗惊厥药物和毒素的作用靶标。Sigma-1受体也主要分布于CNS，主要参与调节细胞膜上的离子通道、神经元的电活动以及递质释放等过程。Sigma-1受体的多种配体，主要用于抗精神疾病、抗心律失常及镇咳等方面的治疗。其中，(+)-SKF10047，是一种sigma-1受体的选择性激动剂，一直被作为研究sigma-1受体的常用工具药物。已有研究表明(+)-SKF10047可以通过sigma-1受体的激活对Na+、K+、Ca2+等离子通道进行调节。 本研究中，使用大量表达内源sigma-1受体的HEK293T细胞和几乎不表达内源sigma-1受体的COS-7细胞系作为模型，通过在HEK293T和COS-7细胞系中瞬时表达大鼠的NaV1.2、NaV1.4和NaV1.5离子通道，并使用sigma-1受体的选择性激动剂(+)-SKF10047、PRE-084和DM（Dextromethorphan），以及拮抗剂BD1047和NE-100作为主要的工具药物，主要研究了sigma-1受体的激动剂对NaV1.2通道的调节作用机制。 使用膜片钳全细胞记录的方法，记录通道在给药前后的电流INa的变化。在HEK293T细胞中表达NaV1.2，100μM的(+)-SKF10047对INa产生瞬时抑制作用，且在1～2 min内达到稳定，抑制率约为40％，并且该药物对INa的抑制作用具有浓度依赖性、频率依赖性和使用依赖性。该药物对NaV1.2的稳态激活特性没有影响，但能够显著地促使NaV1.2的稳态失活曲线向超极化方向偏移约27mV。同时，使用sigma-1受体的特异性拮抗剂BD1047或NE-100不能抑制(+)-SKF10047对INa的抑制作用;使用sigma-1受体的shRNA质粒干扰HEK293T细胞内源sigma-1受体的表达，或者在COS-7细胞中过表达NaV1.2通道，或者在COS-7细胞中共同过表达sigma-1受体和NaV1.2通道，再给药(+)-SKF10047，其对INa的抑制作用均不发生明显改变。在电极内液中给药PKA信号通路阻断剂H-89和PKAI、PKC信号通路阻断剂BIM I和G(o)6976、G蛋白的拮抗剂NF023和NF449以及G蛋白的激动剂GTPγS，均不能影响(+)-SKF10047对NaV1.2的抑制作用。此外，胞外孵育毒素PTX和CTX来不可逆地改变G蛋白信号，同样不改变(+)-SKF10047对NaV1.2的抑制作用。通过基因定点突变，突变NaV1.2通道上的局麻药结合位点氨基酸W1716、F1764、Y1771后，发现F1764A点突变对(+)-SKF10047的作用有显著抑制，W1716C不影响药物对INa的抑制作用，Y1771A则使INa的抑制率稍有升高。通过在不同的刺激频率下给药记录，发现(+)-SKF10047对NaV1.2电流的抑制作用能随刺激频率的升高而增强，并能够使NaV1.2通道电流从失活中恢复的速度显著减慢，同时药物的作用具有使用依赖性，说明药物更容易与去极化状态下的通道发生结合。 另外，在HEK293T中瞬时表达NaV1.4或NaV1.5通道，并给药100μM的(+)-SKF10047，发现药物对钠电流的抑制率均在40％以上。而在COS-7细胞中瞬时表达NaV1.4或NaV1.5通道，给药后INa抑制率与HEK293T细胞上的结果没有显著性差异。在颗粒神经元和皮层神经元上，给药100μM的(+)-SKF10047后，细胞总体的内向钠电流同样受到抑制，抑制率分别为31.1±2.6％和38.0±1.8％。此外，与(+)-SKF10047同属一类的另一个sigma-1受体的选择性激动剂DM，对HEK293T和COS-7中外源表达的NaV1.2电流的抑制作用分别约为65％和68％。且该药物对INa的抑制作用亦不能被BD1047或NE-100所阻断，而NaV1.2的F1764A点突变则可以显著降低该药物对INa的抑制作用。另一种类的sigma-1受体选择性激动剂PRE-084对HKE293T中瞬时表达的NaV1.2的INa抑制作用则较低，约为14％。 根据以上的研究结果，我们首次提出sigma-1受体的选择性激动剂(+)-SKF10047对NaV1.2离子通道的抑制作用不依赖于sigma-1受体的激活或G蛋白或者PKA、PKC信号通路，而是通过药物直接与通道的孔区结构的关键位点结合，改变通道的构象，从而抑制INa。并且，推测苯基吗啡类的sigma-1受体的激动剂可能以同样的直接作用的方式抑制NaV1.2。同时，(+)-SKF10047对NaV1.4、NaV1.5及神经元钠通道的抑制作用，也表明该sigma-1受体的激动剂对VGSC可能具有普遍性的抑制作用。而sigma-1受体的配体对于其它类型的VGSC的抑制作用机制尚有待进一步探究。这不仅能够进一步了解sigma-1受体配体的药理学作用机制，避免临床用药的交叉作用，而且也能为新药的开发提供新的理论参考。