研究背景与目的:乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是乙型脑炎的病原体,属于虫媒传播病毒,是病毒性脑炎的主要病因之一。乙型脑炎是人畜共患的自然疫源性疾病,主要以蚊虫为媒介进行传播。猪、马和水禽等脊椎动物可以感染乙型脑炎病毒,是主要的病毒扩增宿主,而人类是终末宿主。乙型脑炎病毒主要分布在东南亚的24个国家、大洋洲北部和西太平洋地区。目前,WHO每年报告的乙型脑炎患者近万人,重症患者主要表现为高热、头痛、昏迷、抽搐等症状,出现疾病症状者的病死率可高达30%,约30%-50%的重症存活者伴有瘫痪、智力障碍等神经系统后遗症。然而,由于疫区游客数量的增加、非疫区输入性病例的升高以及气候变化导致的蚊虫媒介的扩散和病毒变异的发生,在部分国家或地区乙型脑炎时有暴发与流行,其现状仍不容忽视。目前,尚无针对JEV的特效抗病毒药物,其与宿主之间的关系及致病机制等问题也尚未明确。因此,乙型脑炎仍是重要的国际性公共卫生问题,对其致病机制与发病机理进行深入研究,有助于研发特异性的抗病毒药物及有效的治疗措施。疫苗是预防病毒感染的最有效措施,乙型脑炎病毒减毒活疫苗株SA14-14-2是我国应用最广泛的疫苗。然而关于减毒活疫苗SA14-14-2的减毒机制尚未完全清楚,利用反向遗传学(reverse genetics)构建乙型脑炎病毒减毒活疫苗株SA14-14-2的感染性克隆将有助于分析病毒的基因功能、致病机制和生命周期等,甚至可用于嵌合疫苗的开发。但黄病毒属病毒基因组在大肠杆菌内复制时存在遗传不稳定性,序列常自发插入、缺失或突变,同时,c DNA自身或表达的蛋白对大肠杆菌有一定的毒性,限制了病毒全长感染性克隆的构建。因此,构建乙型脑炎病毒减毒活疫苗株SA14-14-2的感染性克隆十分必要,以此为模型探究该疫苗的减毒机制,有助于认识JEV侵入中枢神经系统引起神经元细胞损伤的机制,对于研发JEV引起的中枢神经系统感染和致病的治疗药物具有重要意义。JEV属于嗜神经性病毒,能够突破血脑屏障侵入中枢神经系统(central nervous system,CNS)引起脑炎,造成严重的中枢神经系统感染及其并发症。然而,目前关于JEV感染神经系统的分子机制尚未十分清楚。JEV感染宿主细胞是一个复杂的过程,包括病毒对宿主细胞的入侵以及病毒在宿主细胞内的复制、组装以及释放。在这些感染过程中,JEV的感染常引起宿主细胞内环境的变化,造成宿主细胞大量基因的激活或抑制,涉及许多的信号通路与宿主细胞分子,某些发生变化的基因有利于机体发挥抵御病毒感染的作用,同时某些基因也可被病毒所利用和挟持,从而促进病毒自身的复制。由于中枢神经系统内缺乏次级淋巴组织,不能产生适应性免疫应答,因此神经细胞内的天然免疫应答对限制JEV的感染是十分重要的。鸟苷酸结合蛋白5(guanylate binding protein 5,GBP5)属于干扰素刺激基因(interferon stimulate gene,ISG),其在嗜神经性病毒中的作用机制尚未明确。因此,探究GBP5在JEV感染神经细胞中的作用有助于对JEV神经致病性的深入了解。泛素蛋白酶体系统和自噬溶酶体系统是调节蛋白分解代谢的两条主要途径。E3泛素连接酶神经前体细胞表达下调因子4(neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated 4,Nedd4)在这两个系统之间起着联系的作用,其在JEV致病机制中所发挥的作用尚未明确。因此,探究Nedd4的作用将有助于了解宿主因子在JEV感染神经细胞中的作用,同时,也为抗病毒药物提供新的作用靶点。一、乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2感染性克隆的构建研究方法:将JEV减毒活疫苗株SA14-14-2分两段合成,在第一段引入同义突变A356G和T359C,并且在基因组nt356和nt2217处引入内含子序列以稳定基因组序列,通过酶切连接的方法将上述两片段与载体p ACNR进行连接,构建p ACNR-SA14-14-2全长c DNA质粒。以c DNA为模板,通过体外转录合成具有感染性的病毒RNA,通过电转染方法转入BHK-21细胞中进行病毒的拯救,观察细胞病变效应,并利用空斑形成试验和免疫荧光试验鉴定拯救病毒。对亲本病毒和拯救病毒绘制生长曲线,并利用小鼠检测拯救病毒的神经毒力和神经侵袭力。结果:25℃培养温度不能稳定JEV的基因组,而在基因组衣壳蛋白基因区(nt356)和包膜蛋白基因区(nt 2217)引入内含子序列,可以得到稳定增殖的克隆。通过酶切鉴定和测序鉴定,成功构建SA14-14-2全长c DNA质粒模板,顺利得到拯救病毒,经测序鉴定所得拯救病毒中并不含有内含子序列,经免疫荧光试验检测到拯救病毒E蛋白、NS1病毒蛋白和NS3病毒蛋白的表达。拯救病毒与亲本病毒的空斑大小与形态类似,同时具有类似的增殖特性。小鼠感染试验显示在2×10~2PFU和5×10~4PFU的病毒量时,拯救病毒与亲本病毒对小鼠均无神经毒力和神经侵袭力。结论:本研究成功构建了JEV减毒活疫苗株SA14-14-2的感染性克隆,获得拯救病毒,为研究JEV的致病机制和减毒机制提供了基础。二、鸟苷酸结合蛋白5(GBP5)抑制JEV感染神经细胞的研究研究方法:在SH-SY5Y细胞中,采用GBP5蛋白的干扰RNA下调GBP5表达,或使用过表达质粒上调GBP5表达,然后检测GBP5对JEV感染性的影响。利用病毒结合实验和病毒内化实验检测GBP5对细胞入侵过程的影响。通过转染JEV复制子RNA检测GBP5对JEV复制的影响。利用GBP5功能突变质粒和截短体分析GBP5在JEV感染中的作用,明确功能序列。随后利用GBP5功能突变质粒检测其对Furin蛋白的影响以及Furin蛋白对JEV感染的影响。结果:JEV感染可以诱导HUVEC细胞和Huh7细胞中GBP5的表达,并随感染剂量的上升而升高,而在SH-SY5Y细胞和SK-N-SH细胞中,JEV的感染可以引起GBP5的下调,并随感染剂量的增加而降低。在SH-SY5Y细胞内增加GBP5的含量,可明显抑制JEV的感染;下调GBP5的表达则可促进JEV的感染。GBP5在JEV入侵SH-SY5Y细胞的过程中不发挥作用,其影响JEV的入侵后过程,包括复制和子代病毒感染性。破坏GBP5异戊二烯化作用的C583A功能突变质粒失去抗JEV的作用。进一步检测发现GBP5可以下调Furin的表达,并通过Furin蛋白影响JEV在SH-SY5Y细胞内的感染性。结论:GBP5具有显著的抗JEV效果,其通过GBP5的异戊二烯化作用发挥对JEV的抗病毒作用,其可以通过作用于Furin蛋白影响JEV的感染。GBP5在JEV感染神经细胞后的低表达可能涉及病毒对宿主抗病毒机制的挟持,从而促进病毒在细胞内的感染。GBP5在神经细胞中的变化为阐明JEV的神经致病机制提供了新的思路。三、E3泛素连接酶Nedd4促进JEV感染神经细胞的研究研究方法:在SK-N-SH细胞中,采用Nedd4蛋白的干扰RNA下调Nedd4或过表达质粒上调Nedd4表达,检测Nedd4对JEV感染性的影响。利用病毒结合实验和病毒内化实验检测Nedd4对入侵过程的影响。通过转染JEV复制子RNA检测Nedd4对JEV复制的影响。随后通过免疫印迹检测JEV感染时LC3I/II蛋白的转化并利用m Tag RFP-m Wasabi-LC3检测细胞内自噬水平。随后通过Beclin1的干扰RNA验证自噬在JEV感染SK-N-SH细胞中的功能。最后检测在JEV感染时Nedd4与Beclin1和自噬之间的联系。结果:JEV感染可以诱导SK-N-SH细胞中Nedd4的表达,并随感染进程而升高。在SK-N-SH细胞中下调Nedd4的表达,可显著抑制JEV的感染;上调Nedd4的表达则可促进JEV在SK-N-SH细胞内的感染。下调Nedd4不影响JEV对SK-N-SH细胞的入侵过程,但能显著抑制JEV的复制。JEV感染SK-N-SH细胞可激活细胞内自噬,而抑制SK-N-SH细胞内的自噬可促进JEV复制。在JEV感染时,下调Nedd4可诱导Beclin1的表达,从而促进自噬的发生,进而抑制JEV的复制。在非神经细胞中,下调Nedd4的表达不影响JEV的感染性。结论:Nedd4在JEV感染神经细胞的过程中发挥着重要的作用。JEV感染可以促进神经细胞内Nedd4的表达升高,下调Nedd4可促进Beclin1蛋白的表达并增强细胞自噬,从而抑制JEV的复制。表明JEV感染神经细胞可以挟持细胞内的Nedd4,通过抑制细胞内的自噬,进而促进JEV在神经细胞内的感染。Nedd4和自噬在神经细胞中的作用有助于解析JEV的神经致病机制,也为抗病毒药物的研发提供了潜在的作用靶点。小结:目前,对于JEV神经致病性方面的研究仍较少。JEV的结构蛋白和非结构蛋白在感染神经细胞中所起的作用以及宿主因子在JEV感染神经细胞中所发挥的作用及相关机制仍未清楚。本研究成功构建了JEV减毒活疫苗株SA14-14-2的感染性克隆,获得拯救病毒,为研究JEV的神经致病机制提供了基础。病毒建立有效的感染不仅取决于病毒自身的致病性,也依赖于宿主的抵抗力,是病毒与宿主两方面共同作用的结果。本研究发现,一方面,JEV在感染神经细胞后可抑制抗病毒蛋白GBP5的表达,干扰其抗病毒作用,从而促进病毒在神经细胞内的感染。另一方面,JEV感染也可以促进神经细胞内Nedd4的表达升高,通过抑制神经细胞内的自噬进而有利于JEV在神经细胞内的感染。上述研究结果有助于了解JEV的生物学特性和神经致病性,对阐明JEV的神经致病机制具有重要意义,也为抗病毒药物的研发提供了潜在的作用靶点。