目的:　　 自从20世纪80年代将金属支架用于冠状动脉介入治疗后，在冠状动脉内植入支架治疗已经成为最主要的治疗冠心病的模式。但是支架植入成功6个月后仍会有20％-30％的再狭窄发生。316L和317L作为目前应用最为广泛的冠状动脉内不锈钢金属支架材料，其通常含有10％-14％的镍元素，研究认为316L和317L不锈钢金属支架材料中镍元素的离子释放引起的接触过敏加重了炎症反应，刺激支架周围的新生组织的增生，因而增大了再狭窄的可能性。因此目前正在开发的一种新型高氮无镍（High nitrogen nickel free，HNNF）不锈钢金属支架材料，旨在通过去掉镍元素降低镍离子的潜在危害性及动脉支架内再狭窄率。本研究旨在探究HNNF不锈钢金属支架材料与316L不锈钢金属支架材料对人血管内皮细胞和平滑肌细胞生长的影响，从而为降低镍离子的潜在危害性和血管支架内再狭窄率以及新型不锈钢金属支架材料的研发应用提供实验资料和理论依据。本实验通过研究HNNF不锈钢金属支架材料和316L不锈钢金属支架材料对人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)和人脐动脉血管平滑肌细胞（Human Umbilical Artery Smooth Muscle Cell，HUASMC）的细胞形态、细胞的生长活性、细胞周期、细胞凋亡和基因表达等方面的影响，为探究血管支架内再狭窄机制，新型支架材料的研发提供理论依据和实验基础。　　 实验材料与方法:　　 一、细胞粘附的测定　　 将培养的HUVEC和HUASMC两种细胞制成细胞悬液，接种于置有316L和HNNF两种不锈钢金属材料的24孔培养板中，并设有正常培养细胞的对照组。各组均用完全培养液培养，置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱内进行复合培养。培养4h后取出样本，PBS液冲洗，去除未粘附细胞，用0.25％的胰酶消化后收集，台盼蓝染色后，倒置显微镜下细胞计数板计数，计算相对于对照组细胞的细胞粘附百分比。　　 二、观察细胞生长状况　　 将体外培养的HUVEC和HUASMC两种细胞制成细胞悬液，接种于各组24孔培养板中，将24孔培养板放入37℃、5％CO2培养箱中分别培养3天和7天，待细胞基本长成单层，取出长有细胞的金属片，用姬姆萨染液进行细胞染色，置于光学显微镜下观察HUVEC和HUASMC两种细胞在两种不锈钢金属材料表面上的细胞生长状况。用Calcein AM染液进行细胞染色，置于荧光显微镜下观察HUVEC和HUASMC两种细胞在两种不锈钢金属材料表面上的细胞生长状况。从形态上观察HNNF和316L两种不锈钢金属材料对HUVEC和HUASMC两种细胞细胞生长状况的影响。　　 三、细胞生长活性的测定　　 取对数生长期的HUVEC和HUASMC细胞，将细胞制成细胞悬液，接种于各组24孔培养板中，将24孔培养板放入37℃、5％CO2培养箱中，各组均在开始培养后的1、3、5、7天取样，通过CCK-8比色法测定细胞的生长活性，用酶联免疫检测仪于450nm波长处测定每孔的OD值，求出每一组的平均OD值。计算细胞的相对增殖率(relative growth rate，RGR): RGR=（实验组OD值/对照组OD值）×100％，对各组结果进行评价。定量分析316L和HNNF两种不锈钢金属材料对HUVEC和HUASMC两种细胞的细胞增殖及细胞生长活性的影响。　　 四、细胞生长曲线的测定　　 取对数生长期的HUVEC和HUASMC细胞，将细胞制成细胞悬液，接种于各组24孔培养板中，将24孔培养板放入37℃、5％CO2培养箱中，各组均在开始培养后的7天内连续收集细胞，制成细胞悬液，并通过台盼蓝染色后在光学显微镜下进行细胞计数，并绘制细胞生长曲线。　　 五、细胞周期分析　　 取对数生长期的HUVEC和HUASMC细胞，制成细胞悬液，接种于各组6孔培养板中，将各组细胞均置于37℃、5％CO2培养箱中培养。每组细胞均在开始培养7天后用不含血清的新鲜培养液饥饿培养22h，再更换为含有10％胎牛血清的完全培养液培养24h，在不同时间点分别取样，并收集细胞置于离心管中，通过流式细胞仪进行细胞周期分析。定量分析316L和HNNF两种不锈钢金属支架材料对HUVEC和HUASMC两种细胞细胞周期的影响。　　 六、细胞凋亡检测　　 取处于对数生长期的HUVEC和HUASMC细胞，制成细胞悬液，接种子各组6孔培养板中，将各组细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。各组均在开始培养后的7天取样，并收集细胞置于离心管中通过流式细胞仪对细胞凋亡进行检测。定量分析316L和HNNF两种不同不锈钢金属支架材料对HUVEC和HUASMC两种细胞细胞凋亡的影响。　　 七、实时定量PCR检测　　 取处于对数生长期的HUVEC和HUASMC细胞，制成细胞悬液，接种于各组6孔培养板中，各组均置于37℃、5％CO2培养箱中培养。各组均在开始培养后的7天取样，并收集细胞置于1.5 mL离心管中，做好标记。按照TRIzol说明书的要求提取RNA，测定各组RNA纯度和浓度。按照Takara说明书的要求，反转录得到DNA模板，然后按照Takara说明书的要求进行Real-Time PCR的检测。以基因GAPDH作为内参，定量分析316L和HNNF两种不锈钢金属支架材料对HUVEC和HUASMC两种细胞基因水平表达的影响。　　 结果:　　 1、通过镜下对HUVEC和HUASMC两种细胞细胞形态和细胞数目的观察、CCK-8实验对HUVEC和HUASMC两种细胞细胞增殖活性的检测和流式细胞仪对HUVEC和HUASMC两种细胞细胞周期的检测可以看出培养在HNNF不锈钢金属材料上的HUVEC细胞其细胞生长水平低于在316L不锈钢金属材料上培养的HUVEC细胞(p＜0.05)，但高于HUVEC细胞在体外培养的正常水平(p＜0.05);培养在HNNF不锈钢金属材料上的HUASMC细胞其生长水平低于在316L不锈钢金属材料上培养的细胞(p＜0.05)，同时也低于HUASMC细胞在体外培养的正常水平(p＜0.05)。　　 2、通过流式细胞仪对细胞凋亡的检测可以看出培养在316L不锈钢金属材料上的HUVEC细胞在培养7天后其细胞早期凋亡的比例比培养在HNNF不锈钢金属材料上的HUVEC细胞比例高。培养在HNNF不锈钢金属材料上的HUASMC细胞在培养7天后其细胞早期凋亡的比例比培养在316L不锈钢金属材料材料上的HUASMC细胞比例高。　　 3、通过实时定量PCR的结果可以看出培养在316L不锈钢金属材料上的HUVEC细胞其与凋亡相关的基因和与自噬相关的基因表达水平比培养在HNNF不锈钢金属材料上的HUVEC细胞值高(p＜0.05)，说明316L不锈钢金属材料比HNNF不锈钢金属材料可能更易诱导细胞凋亡，与细胞凋亡检测的结果一致。　　 4、培养在316L不锈钢金属材料上的HUVEC细胞其基因Fas，caspase-8和caspase-3的mRNA水平的上调说明从316L不锈钢金属材料释放出的镍离子可能通过Fas基因介导的外源凋亡途径诱导了HUVEC细胞的细胞凋亡。　　 5、通过实时定量PCR的结果可以看出培养在HNNF不锈钢金属材料上的HUASMC细胞其与凋亡相关的基因和与自噬相关的基因表达水平比培养在316L不锈钢金属材料上的HUASMC细胞值高(p＜0.05)，说明HNNF不锈钢金属材料比316L不锈钢金属材料可能更易诱导HUASMC细胞的细胞凋亡，提示HNNF不锈钢金属材料比316L不锈钢金属材料可能更易抑制血管平滑肌细胞的增殖，与HUASMC细胞细胞凋亡检测的结果一致。　　 6、培养在HNNF不锈钢金属材料上的HUASMC细胞其基因Fas、caspase-8、caspase-3和caspase-9的mRNA水平较培养在316L不锈钢金属材料上的HUASMC细胞其相应基因mRNA水平上调，说明HNNF不锈钢金属材料可能通过Fas基因介导的外源凋亡途径和线粒体介导的内源途径两种途径诱导了HUASMC细胞的细胞凋亡。　　 结论:　　 1、通过细胞形态的观察、细胞生长活性、细胞周期和细胞凋亡的检测以及实时定量PCR的检测，发现HNNF不锈钢金属支架材料同对照组相比具有促进血管内皮细胞增殖的作用。　　 2、与316L不锈钢金属支架材料相比，HNNF不锈钢金属支架材料具有抑制血管平滑肌细胞增殖的作用，同时由于其不含有镍元素，从而降低了316L不锈钢金属支架材料中镍元素对细胞的潜在毒性作用。　　 3、本实验的实验结果为降低血管支架内再狭窄以及新型HNNF不锈钢金属支架材料的开发应用提供了实验资料和理论依据。