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草鱼呼肠孤病毒是一具有高致死性和高传染性从而造成草鱼出血病的主要病毒病原,属于水生呼肠孤病毒属并且是该属中致病力最强的毒株之一。其病毒主要分为三种基因型,分别是以GCRV 873为代表株的Ⅰ型、GCRV HZ08为代表株的Ⅱ型和以HGDRV（GCRV 104）为代表株的Ⅲ型。本课题的研究主要利用现代分子生物学技术,验证草鱼呼肠孤病毒粒子负责识别吸附宿主的外衣壳蛋白VP5和VP7二者之间相互作用的关系,以及不同基因型GCRV在细胞内的增殖动态和其病毒进入细胞的机制,主要研究内容如下:1.GCRV外衣壳蛋白VP5与VP7之间相互作用结构域的鉴定及分析草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP5和VP7位于病毒粒子最外层形成异源二聚体,负责识别吸附宿主细胞,进而侵染宿主。本章节研究通过酵母双杂交体系初步证实了VP5和VP7之间存在相互作用,并通过原核表达和杆状病毒表达系统分别表达VP5和VP7蛋白,进行Dot-Blot Overlay实验进一步证实二者之间相互作用。为初步验证VP5和VP7蛋白之间相互作用结构位点,分别对编码VP5和VP7蛋白基因进行截断,以截断后基因表达蛋白和全长基因表达蛋白进行酵母双杂交实验,结果显示,VP5截断后基因表达蛋白与VP7全长基因表达蛋白全部存在相互作用,而VP7截断基因表达蛋白与VP5全长基因表达蛋白不存在相互作用,因此我们推测,VP5与VP7蛋白之间的相互作用关系,其VP5蛋白上存在多个结合位点。2.两种基因型草鱼呼肠孤病毒的增殖动力学对Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV JX01）和Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV 104）两种基因型毒株感染宿主细胞的病毒增殖动力学进行比较,分别在相同感染条件下感染两种株型病毒,根据不同时间点上清滴度的测定、以及病毒粒子在宿主细胞内的表达增殖量,研究其两种基因型草鱼呼肠孤病毒增殖动力学。结果表明,Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV 104）与Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV JX01）的侵染宿主细胞增殖感染过程相比较来看,Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV 104）更加缓慢。依据先前对Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV JX01）入侵途径的研究报道,本章对Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV 104）入侵途径做一初步的探讨。根据NH4Cl和Dynasore抑制剂对应的通路途径,使用该两种抑制剂对CIK细胞进行相应处理后感染Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV 104）,发现NH4Cl对Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV104）感染宿主细胞CIK的抑制效果非常明显,Dynasore也具有较明显的抑制效果,因此我们得出结论,Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV 104）是在低pH环境下,依赖于发动蛋白dynamin的作用侵染宿主细胞。3.Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV 104）入侵途径的研究本章节中我们对Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV 104）入侵途径进一步地研究探讨。通过11种抑制剂进行相对应的通路筛选。不同抑制剂分别对CIK细胞进行相应处理后,感染Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV 104）,随后根据上清中病毒滴度的定量,分析不同抑制剂对Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV 104）的抑制效果,初步筛选出有四种抑制剂对Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV 104）感染CIK细胞具有显著的抑制效果,即针对网格蛋白介导内吞途径（CME）的CPZ和Pistop2、PKC抑制剂Rottlerin和PI3K抑制剂Wortmannin。为进一步证实该四种抑制剂对Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV 104）的抑制作用,我们设计了Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV 104）进入细胞水平实验,通过对进入宿主细胞的病毒粒子定量及病毒蛋白在细胞内表达情况进行验证分析。其中针对网格蛋白介导内吞途径（CME）的抑制剂CPZ和Pistop2,对Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV JX01）和Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV 104）两种基因型病毒的进入都具有显著的抑制作用,与先前对Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV JX01）入侵途径研究一致,从而进一步证实了Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV104）入侵宿主细胞是利用网格蛋白介导的内吞途径。而在病毒进入细胞水平实验中,Rottlerin和Wortmannin两种抑制剂对Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV 104）进入宿主细胞同样具有显著的抑制作用,该两种抑制剂分别对应抑制蛋白激酶C（PKC）与磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的作用,因而也说明了Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV104）入侵宿主细胞过程中借助于PKC与PI3K的相关作用。根据病毒感染及进入宿主细胞两个水平的实验验证,我们得出结论,Ⅲ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV 104）入侵宿主细胞,是在低pH环境下,通过发动蛋白Dynamin、以及PKC和PI3K的辅助作用,依赖于网格蛋白介导的内吞途径完成其病毒感染过程。