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目的：
利用MicroRNA基因芯片技术,筛查HPV16(+)宫颈鳞癌组织中异常表达的miRNA基因谱,选取兴趣基因,进行分析,初步探讨基因异常表达的临床意义
材料与方法：
一、材料
实验组3例:选择收集2009年9月到2010年10月中国医科大学附属盛京医院妇产科确诊为宫颈鳞癌Ib期(HPV16+)并行手术治疗的患者共3例,手术方式为经腹广泛性全子宫切除术+盆腔淋巴结清扫。对照组3例:选取实验组患者宫颈正常切缘组织。
二、主要试剂
主要试剂及仪器:Trizol试剂(R)试剂盒(Invitrogen生命技术),miRCURYTMArray Power标记试剂盒(Cat＃208032-A,Exiqon),miRCURYTM Array洗涤液试剂盒(Cat＃208021,Exiqon),miRCURYTM芯片(Exiqon),移液器及吸头,分光光度仪,GenePix4000B芯片扫描仪
三、方法
基因芯片技术
将约50-100mg新鲜样本组织块放入1.5ml Eppendorf管中液氮保存,从液氮中取出Eppendorf管,使用BioPluverizerTM冰冻粉碎组织,加入1ml Trizol(Invitrogen)混匀后,使用MiniBead-Beater-16匀浆后提取RNA。使用Nanodrop测定RNA在分光光度计260nm、280 nm、230 nm的吸收值,以计算浓度并评估纯度。用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳,检测RNA纯度及完整性。用标记酶将Hy3TM或Hy5TM荧光集团标记合格的RNA(miRCURYTM Array Power标记试剂盒,Exiqon公司),具体芯片杂交标记及杂交由上海康成生物公司完成。
四、统计学分析
利用GenePix4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度,并将实验结果转换成数字型数据,通过T-test筛选出的差异表达miRNA(p≤0.05)并根据这些miRNA的分层聚类。利用Scatter Plot等软件对数据进行分析,得出具有统计学意义的差异表达基因,筛选兴趣基因,通过(MICROCOSM,TARGETSCAN,PICTAR-VERT)预测差异miRNA的靶基因,进行GO、pathway分析。
结果：
1、72个miRNA的表达差异具有统计学意义,其中68个表达上调,4个表达下调
2.选取miR-155,miR-218,miR-21,miR-24,miR-214为兴趣基因,进行后续GO、pathway分析。
结论：
利用基因芯片,筛查HPV16(+)宫颈鳞癌组织中异常表达的microRNA,我们预测异常表达的72个microRNA与HPV16导致的宫颈癌的发生、发展、转移等密切相关,其异常表达在疾病发展中起重要角色,对疾病的诊治及预后起关键作用。