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目的肿瘤已经成为全球最大的公共卫生安全问题。目前肿瘤治疗手段主要以放疗、化疗、手术和靶向治疗为主,这几种方法存在患者经济负担重、不耐受、副作用大等问题。因此,寻找经济、安全、高效和低毒的抗癌药,延长肿瘤患者生存期,提高患者生存质量成为当前重要课题。美洲大蠊精制物CⅡ-3及人工合成短肽HFDT1是大理大学云南省药用昆虫及蛛形类资源开发利用工程实验室研制的以多肽为主的药物,多项实验研究表明其具有抗肿瘤作用,但其抗肿瘤分子机制尚未完全了解。本文通过建立BALB/c小鼠MFC荷瘤模型,给予CⅡ-3及HFDT1处理,研究其对荷瘤小鼠PD-1及CTLA-4表达的调节与作用机制,为多肽类药物研究提供理论基础。方法实验室复苏MFC细胞株,培养达到一定数量后,接种于6～8周龄,18～20g,SPF级BALB/c小鼠右侧腋皮下,建立小鼠MFC荷瘤模型。随机将荷瘤小鼠分为5组:模型组、CTX组、CⅡ-3低剂量组、CⅡ-3高剂量组、HFDT1组,另设正常对照组。进行给药处理,正常组及模型组给予无菌生理盐水(灌胃,20m L/kg,q.d)、CⅡ-3低剂量组给予CⅡ-3(灌胃,200mg/kg,20m L/kg,q.d)、CⅡ-3高剂量组给予CⅡ-3(灌胃,400 mg/kg,20m L/kg,q.d)、环磷酰胺(CTX)组给予CTX(腹腔注射,45 mg/kg,10m L/kg,q.2.d)、HFDT1组给予HFDT1(腹腔注射,7.8 mg/kg,10m L/kg,q.d)。小鼠肿瘤模型建立后次日开始给药,连续给药10d。自接种MFC细胞后第5d开始小鼠右侧腋下可触及肿瘤块,之后每隔2d用游标卡尺测量肿瘤块大小,计算肿瘤体积(cm~3),计算公式V=1/2×ab~2(a为长径,b为短径)。小鼠给药10d后,眼眶静脉取血,处死小鼠,无菌取小鼠脾脏及肿瘤,分别测试:(1)计算肿瘤体积增长量、抑瘤率和脾指数。(2)流式荧光抗体染色,测定小鼠外周血及脾脏细胞CTLA-4~+T细胞变化;Western Blot测定脾脏细胞PD-1表达情况。(3)流式荧光抗体染色,分析小鼠脾脏细胞及肿瘤组织PD-L1和树突状细胞PD-L2表达情况;Western Blot测定小鼠脾脏细胞及肿瘤组织PD-L1、PD-L2表达情况。(4)Western Blot测定小鼠脾脏细胞及肿瘤组织PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、m TOR和p-m TOR表达情况。结果1抗肿瘤作用结果显示,CⅡ-3低、高组及HFDT1组均能抑制荷瘤小鼠体内肿瘤的生长,三组药物抑瘤率分别为41.13%、37.44%和45.38%,且抑瘤率HFDT1组﹥CⅡ-3低剂量组﹥CⅡ-3高剂量组。随着实验的进行及给药天数的增加,与正常组和模型组比较,CTX组体重明显下降,CⅡ-3低、高组及HFDT1组体重无明显变化。与正常组比较,CⅡ-3低、高组及HFDT1组脾脏变化不明显,模型组脾脏明显增大,颜色深红,CTX组脾脏明显减小,颜色偏浅。脾指数结果显示,除CTX组外,与正常组比较,模型组、CⅡ-3低组、CⅡ-3高组和HFDT1组脾重均增加,其中模型组脾重最大;与CTX组比较,CⅡ-3低组、CⅡ-3高组和HFDT1组脾重增加(P<0.05)。2流式细胞术分析外周血CTLA-4~+T细胞结果显示,与模型组和CTX组比较,CⅡ-3低、高组和HFDT1组CD3~+CTLA-4~+T细胞比例减少(P<0.05);与模型组比较,CⅡ-3低、高组及HFDT1组CD4~+CTLA-4~+T、CD8~+CTLA-4~+T细胞比例降低(P<0.05)。3流式细胞术分析脾脏CTLA-4~+T细胞结果显示,与模型组比较,CⅡ-3低组、高组及HFDT1组CD3~+CTLA-4~+T细胞比例降低(P<0.05);与模型组和CTX比较,CⅡ-3低、高组及HFDT1组CD4~+CTLA-4~+T、CD8~+CTLA-4~+T细胞比例降低(P<0.05)。4 Western Blot分析脾脏细胞PD-1表达的结果显示,与模型组比较,CⅡ-3低剂量组PD-1表达降低(P<0.05);与CTX组比较,CⅡ-3低剂量组和HFDT1组PD-1表达降低(P<0.05)。其中CⅡ-3低剂量组PD-1相对表达水平最低。5流式细胞术分析脾脏细胞PD-L1表达的结果显示,与模型组和CTX组比较,CⅡ-3低、高组及HFDT1组PD-L1表达降低(P<0.05)。6流式细胞术分析肿瘤组织PD-L1表达的结果显示,与模型组和CTX组比较,CⅡ-3低、高组及HFDT1组PD-L1表达降低(P<0.05)。7流式细胞术分析脾脏树突状细胞PD-L2表达的结果显示:与模型组和CTX组比较,CⅡ-3低、高组及HFDT1组树突状细胞PD-L2表达降低(P<0.05)。8流式细胞术分析肿瘤浸润树突状细胞PD-L2表达的结果显示:与模型组和CTX组比较,CⅡ-3低组和HFDT1组树突状细胞PD-L2表达降低(P<0.05);与CTX组比较,CⅡ-3低组、CⅡ-3高组和HFDT1组树突状细胞PD-L2表达降低(P<0.05)。9 Western Blot分析脾脏细胞PD-L1和PD-L2表达的结果显示,与正常组比较,HFDT1组和CⅡ-3低组PD-L1和PD-L2表达降低(P<0.05);与CTX组和模型组比较,HFDT1组PD-L1和PD-L2表达降低(P<0.05)。10 Western Blot分析肿瘤组织PD-L1和PD-L2表达的结果显示,与模型组和CTX组比较,CⅡ-3低、高组及HFDT1组PD-L1和PD-L2表达降低(P<0.05)。11 Western Blot分析脾脏PI3K/AKT/m TOR表达的结果显示,与模型组和CTX组比较,CⅡ-3低、高组和HFDT1组p-PI3K、p-AKT、m TOR和p-m TOR表达降低(P<0.05);与模型组比较,CⅡ-3低、高组和HFDT1组PI3K表达降低,CⅡ-3低组和HFDT1组AKT表达降低(P<0.05)。12 Western Blot分析肿瘤PI3K/AKT/m TOR结果显示:与模型组和CTX组比较,CⅡ-3低组、CⅡ-3高组和HFDT1组p-PI3K、AKT、p-AKT、m TOR和p-m TOR表达降低(P<0.05);与模型组比较,CⅡ-3低、高组和HFDT1组PI3K表达降低(P<0.05);与CTX组比较,CⅡ-3高组PI3K表达降低(P<0.05)。结论1美洲大蠊精制物CⅡ-3和短肽HFDT1在小鼠体内具有抗肿瘤作用。2美洲大蠊精制物CⅡ-3和短肽HFDT1能下调荷瘤小鼠外周血和脾脏CTLA-4~+T的比例和脾脏细胞PD-1蛋白的表达。3美洲大蠊精制物CⅡ-3和短肽HFDT1能下调荷瘤小鼠脾脏细胞及肿瘤组织PD-L1和PD-L2蛋白的表达,能下调荷瘤小鼠脾脏细胞及肿瘤组织树突状细胞PD-L2的表达。4美洲大蠊精制物CⅡ-3和短肽HFDT1能抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路的激活。初步研究表明,美洲大蠊精制物CⅡ-3和短肽HFDT1所表现的抗肿瘤作用可能是通过减少衰竭性T细胞(PD-1~+CTLA-4~+T)的产生,并降低能与PD-1分子结合的受体PD-L1和PD-L2分子表达,抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路关键蛋白的产生而实现的。